基于毛細管整體柱的復雜體系微分離分析方法學研究.pdf

1、微分析技術是近年來興起的一種快速、高效、經(jīng)濟環(huán)保的新型儀器分析技術。此類技術充分運用微小容器及管路(直徑500μm～10μm)，與現(xiàn)有檢測技術（如UV、MS、熒光等）相結合，通過空間的集約和聚焦，最大限度地提高反應或檢測的效率，并將樣品、溶劑的消耗降至最低。至此，分析化學得以提升至納升水平。微分析技術自問世以來，相關領域研究人員不斷進行創(chuàng)新和改進，其應用范圍已拓展到化工、生物樣品分析、蛋白組學研究、細胞生物學、藥物及代謝產(chǎn)物檢測等諸多領

2、域，并有大量專利、科研論文和技術成果。
　　 對于藥物分析領域而言，復雜體系包含天然產(chǎn)物和生物體液樣品。對于前者而言，包括中藥為主的植物藥、動物藥和礦物藥，它們對于人類的文明與健康水平的提升一直起著至關重要的作用。因此從遠古時代起，對于中藥及天然藥物的研究從未斷絕。然而，中藥配伍和成分復雜，基質、雜質和各活性成分之間的干擾及相互作用機理較為模糊;因此研究一種藥物的成分及其含量，對于其分析方法及儀器技術的要求則更為復雜和高深。而對

3、于生物體液樣品，如血漿和體液、組織液樣品，由于其樣品基質中大量存在的蛋白、干擾離子和其他成分，這會影響藥物的提取，降低分析方法的靈敏度和選擇性;更何況，藥物在體內(nèi)也未必以游離態(tài)存在。因此對于體內(nèi)生物樣品的分離、純化和富集，而后進行有針對性的檢測，這是擺在藥物分析工作者面前的難題。
　　 因此，分離分析復雜體系需要更為快速、靈敏、高效和專屬性較高的檢測技術和分析方法，也刺激了儀器分析和相關技術及方法學研究與應用的進步。時至今日，高

4、效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜聯(lián)用法(LC/MS)和紫外分光光度法(UV)依舊是分析復雜體系樣品最為成熟可靠的手段。當然，這些方法或多或少存在分離模式單一、效率提升空間有限、樣品和溶劑消耗量較大以及小型化受限等缺點。這雖然給分析工作者提出了更多更難的挑戰(zhàn)，但也為微分離分析技術的發(fā)展提供了廣闊的前景。
　　 在各種分析技術中，毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)是其中應用較為廣泛，儀器設

5、備和分析方法較為成熟的一種。它是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術。基本原理是，在外加電場作用下，緩沖液中的離子和毛細管內(nèi)壁的游離硅醇基形成雙電層結構，進而產(chǎn)生一個電勢，即Zeta電勢，產(chǎn)生電滲流（electroosmotic flow，EOF）帶動管內(nèi)離子沿著電場方向遷移。由于緩沖液和待測物離子的電荷-體積比(Charge-size ratio)不同，進而導致各離子在電場中遷移速率的差異。毛細管電泳正是利

6、用這種機理實現(xiàn)了待測物的分離。
　　 相較傳統(tǒng)電泳，毛細管電泳在25-100μm的彈性（聚酰亞胺）涂層熔融石英管中進行樣品的分離和檢測，具有如下特點:容積?。ㄒ桓?00 cm×75μm管子的容積僅4.4μL）;側面/截面積比大，因而散熱快、可承受高電場(100-1000 V/cm);可使用自由溶液、凝膠等為支持介質;在溶液介質下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流。因此，對比其他傳統(tǒng)分析技術（如高效液相色譜法、紫外分光光度法、熒光法和紅外分光

7、光度法等），毛細管電泳有多、快、好、省這四方面優(yōu)勢。
　　 多——分離模式多。代表性技術有毛細管區(qū)帶電泳(CZE)，等電聚焦毛細管電泳(CIEF)，膠束毛細管電動色譜(MEKC)和毛細管電色譜(CEC)等。
　　 快——分析時間相對較短。
　　 好——分離效率高、柱效好。
　　 省——樣品溶劑消耗極小，對環(huán)境污染破壞少。
　　 然而，由于技術的限制，毛細管電泳仍存在一定局限性。例如分離模式相對單一

8、，適用樣品范圍相對有限和重現(xiàn)性不足等等。為解決此類問題，眾多研究者提出了各自的改進方案。如，在運行緩沖液中添加膠束或是手性選擇劑以改善分離，采用壓力輔助，在毛細管中填充顆粒固定相，或是對毛細管內(nèi)壁進行修飾、鍵和等。這些努力在一定程度上提高了毛細管電泳的分離效率，拓展了相關技術的應用范圍。
　　 作為藥物分析領域的研究，本課題將著重于復雜體系的分離分析，結合前人經(jīng)驗、復雜體系特點及毛細管電泳技術的優(yōu)勢，有針對性地將這類快速高效的分

9、析技術應用于藥物分析研究中較難攻克的以中藥、體內(nèi)生物樣品為代表的復雜體系分析測定中。并在藥物質量標準建立、中藥指紋圖譜研究和體內(nèi)藥代動力學研究以及治療藥物監(jiān)測等方面，做出可能的改進和貢獻。
　　 毛細管電色譜技術(CEC)是一種結合了經(jīng)典液相色譜和毛細管電泳兩者優(yōu)點的分離技術，其中毛細管柱的制備是CEC的核心技術。毛細管填充柱是最為傳統(tǒng)和最為成熟的技術之一，流動相通過包裹填料或填充聚合硅膠作為固定相的毛細管柱。但是這種色譜柱也存

10、在很多問題:一方面它需要豐富的填柱經(jīng)驗和嫻熟的燒塞技術;另一方面，塞子的引入又常常會在實驗時導致氣泡產(chǎn)生，使電流中斷而影響實驗的進行。整體柱技術是在毛細管內(nèi)經(jīng)加熱和光照引發(fā)原位合成連續(xù)床層，因而不再需要在柱兩端燒塞子，操作也很簡單;同時可以根據(jù)不同樣品官能團的需要，選擇不同的有機單體及添加劑進行聚合。因此整體柱技術近來發(fā)展迅速，且被廣泛應用于蛋白質組學、基因組學、藥學、食品和環(huán)境領域。
　　 CEC相比HPLC的優(yōu)勢在于微流，這

11、保證了它們優(yōu)良的選擇性和靈敏度，以及低樣品和流動相消耗。而CEC對比CE的優(yōu)勢在于不論待測物是否帶電均可分離，因為此時待測物與固定相間的相互作用成為了可能。
　　 傳統(tǒng)CEC在微粒固定相中進行，這造成一些問題，如需要填料。而整體固定相帶來了新的選擇，它無需填料且柱子易于制備。整體柱為點聚合制備，免去了微粒固定相煩瑣的填料過程。整體柱中液流通過聚合材料的大孔，與微粒固定相相比，帶來了質量轉移效應。
　　 在毛細管液相色譜中

12、，毛細管液相色譜柱是分離分析的核心，毛細管柱的制備是毛細管液相色譜的關鍵。毛細管液相色譜柱可根據(jù)固定相在柱內(nèi)的存在方式分為以下三種:開管毛細管液相色譜柱(open tubular capillary columns)、填充毛細管液相色譜柱（packed capillary columns）、整體毛細管液相色譜柱(monolithic capillarycolumns)。
　　 整體色譜柱(monolithic chromatog

13、raphic column)，又稱棒柱(rod)、連續(xù)床(continuous bed)，它是由單體、交聯(lián)引發(fā)劑、致孔劑的混合物在色譜柱內(nèi)通過原位聚合而成的連續(xù)床固定相，具有制備方法簡單、易于改性、柱效高、滲透性好、可進行快速分離等優(yōu)點。整體柱按其制備方法的不同分為有機聚合物整體柱和無機整體柱兩類，雖然聚合物整體柱具有較好的重復性、化學選材范圍廣、易于制備、適用的pH值范圍寬等優(yōu)點，但其存在溶脹、受熱變形，機械性能差等不足，并且孔徑及孔

14、徑分布難以控制。由自由基引發(fā)聚合而成的整體柱重復性差;紫外引發(fā)需紫外透明的毛細管，涂有聚四氟乙烯的石英管雖紫外透明，但聚四氟乙烯與毛細管結合不緊密，毛細管易斷。硅膠整體柱則在孔徑控制、機械性能、耐溶劑等方面顯示出一定的優(yōu)越性。
　　 綜上所述，基于整體柱技術的微分離分析方法具有高效率，高速度和較好選擇性等特點，但是綜合文獻調研結果，這些技術在復雜體系特別是我們關心的中藥及生物樣品方面運用仍然較少，但是它們的特點又決定了它們可以在

15、進行優(yōu)化后運用在這些領域，因此如何在現(xiàn)有較成熟技術的基礎上完善并轉化為實用是本課題的一個關鍵點。
　　 本研究具體包括如下工作:
　　 首先，我們對毛細管電色譜技術的沿革與發(fā)展進行了較為全面的論述。為更為透徹、深刻地把握該項技術不同分支的優(yōu)缺點，有針對性地選擇適當技術進行復雜體系樣品的分離分析，我們對目前已經(jīng)研發(fā)出來的不同毛細管色譜柱技術，特別是較為通行的三種，即空管毛細管柱、填充毛細管柱和整體毛細管柱以及他們的修飾和改

16、進進行了調查與研究。通過它們各自特點的對比和適用范圍的確證，初步進行有針對性的篩選和分類。同時也對毛細管電色譜技術的發(fā)展和特點進行論述，緊緊圍繞效率的提升和混合分離機理的引入開展后續(xù)研究工作，為發(fā)掘此類技術的潛力作出努力。
　　 而后，根據(jù)文獻調研和先期研究的經(jīng)驗，我們選擇整體毛細管柱為本課題的主要研究方向。具體原因見相關章節(jié)闡述。針對白芷所含的多種香豆素成分，利用其理化性質和結構特點，選取4個活性成分（歐前胡素、珊瑚菜內(nèi)酯、發(fā)

17、卡二醇和異歐前胡素）進行分離和測定。在經(jīng)過一定的電色譜條件優(yōu)化后，我們成功對上述化合物進行了分離和定量測定。同時結果也證明，在電遷移和反相分配-吸附機理雙重作用之下，毛細管電色譜技術因為集成了毛細管電泳和HPLC的技術特點，因此對于同時分離分析復雜體系內(nèi)多個組分非?？焖俸陀行?。如此一來，便證明了毛細管電色譜技術特別是基于整體柱的毛細管電色譜技術，在分離分析復雜體系樣品方面具有廣泛的應用前景。
　　 之后，我們發(fā)現(xiàn)，白芷提取液中仍

18、舊有數(shù)個活性成分無法分離，原因在于，雖然這些成分含量較大，但由于結構非常類似，因此無論傳統(tǒng)高效液相色譜還是毛細管電色譜技術，實現(xiàn)它們的基線分離，特別是藥材基質存在的情況下實現(xiàn)，是較為困難的。研究發(fā)現(xiàn)，應用甲基丙烯酸丁酯整體柱，在一定電色譜條件下，能夠充分分離結構相似的幾個化合物，并對其進行較為準確的定量測定。測定白芷的五個活性成分（花椒毒素、5-甲氧基-8-羥基補骨脂內(nèi)酯、香柑內(nèi)酯、水合氧化歐前胡素和白當歸素）的過程中，還引入了去氧膽酸

19、鈉(SDC)作為“流動固定相”。實踐證明，此膠束毛細管電色譜法對于結構類似物的分離有著較大的優(yōu)勢。然而，此柱技術也存在一定局限性:一是樣品適應性仍需提升。此類整體柱由于內(nèi)部結構及所帶電荷的特征，多用于分離弱酸性和中性化合物，對堿性化合物實現(xiàn)分離極為困難。第二，也是相當突出的問題在于，甲基丙烯酸丁酯由于碳鏈較短(C=4)，為保證柱效，往往必須聚合出極為緊密的內(nèi)部結構，這就使得柱通透性大打折扣。低通透性不但會帶來較高的背壓(＞1500psi

20、)，內(nèi)部多小孔的構造也容易產(chǎn)生氣泡，進而帶來電流中斷和容易堵塞等嚴重問題。故針后續(xù)研究必須針對此類問題進行改進。
　　 由于甲基丙烯酸丁酯整體柱已經(jīng)有較多應用實例，且本課題組將其成功用于分離分析白芷中香豆素類似物。對于同樣含有大量香豆素成分的蛇床子，在一些方面仍有潛力可供挖掘。其中，蛇床子藥材的提取仍然停留在使用超聲、回流等傳統(tǒng)技術的階段，缺乏自動化程度較高、提取快速高效的技術手段。加速溶劑萃取(ASE)提供了一個很好的解決方案

21、，大大提升了藥材的提取效率。在ASE的幫助下，樣品更為富集，純度也大大提升，實現(xiàn)了最優(yōu)實驗條件下對蛇床子素和歐前胡素的快速、同時測定。
　　 在成功進行了兩種藥材活性成分的測定后，為拓展CEC的應用前景，并測試其對體內(nèi)生物樣品分析的適應性，我們將對蛇床子的研究深化到其體內(nèi)藥代動力學參數(shù)的監(jiān)測上來。選擇70％乙腈作為樣品溶劑，動物實驗所采集的血漿樣品使用蛋白沉淀法進行前處理，而后測定目標化合物的藥代動力學曲線。結果顯示，甲基丙烯酸

22、酯毛細管整體柱在柱效、靈敏度和耐用性等方面符合體內(nèi)藥代動力學研究的要求，能夠適用于體液樣品的分離分析。
　　 針對甲基丙烯酸丁酯整體柱存在的通透性較差，易產(chǎn)生氣泡等缺點，為適應快速大通量分析并使整體柱實現(xiàn)在線沖洗，采用以硅膠-ADDA混合整體柱為技術基礎的新固定相。此類無機-有機混合整體柱，是有機固定相和硅膠基質在催化劑作用下發(fā)生聚合反應產(chǎn)生帶季氨基的陽離子單體。其電滲流特征與甲基丙烯酸丁酯整體柱類似，但機械強度更好，通透性極佳

23、，可完全實現(xiàn)柱上沖洗。此無機-有機混合整體柱被成功運用于與在線微透析采樣技術結合，測定大鼠中頭孢地尼的藥代動力學參數(shù)。同時，此技術與微透析采樣相結合，實現(xiàn)了在線、實時采樣和動態(tài)監(jiān)測。結果顯示，此方法具有高自動化、快速、高效、靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點。大大拓展了整體柱在復雜體系分析中的應用。
　　 最后，在進行了上述一系列研究之后，仍然有諸多問題沒有得到解決。諸如電色譜整體柱制備和保存較為麻煩，重現(xiàn)性不易保證，分析測定前的平衡需要