小檗堿抑制腫瘤細胞Cyclin D1相關(guān)信號通路的研究.pdf

1、目前，腫瘤的發(fā)病率和死亡率在中國乃至世界仍居高不下，它不僅給患者本人及其家庭帶來巨大的痛苦，同時也對整個社會的發(fā)展與進步造成極大的威脅。因此，尋求安全、有效、低毒的抗腫瘤藥物一直受到國內(nèi)外醫(yī)藥界專家學者的重視，而從天然化合物中開發(fā)此類藥物也成為研究熱點。所有癌細胞的一個特異性表型異常是細胞周期調(diào)控失調(diào)，細胞周期的調(diào)控與多種細胞內(nèi)信號通路有關(guān)，阻斷細胞內(nèi)信號通路從而抑制細胞周期正調(diào)控相關(guān)蛋白表達是抑制腫瘤細胞異常增殖的關(guān)鍵。本研究在確定小

2、檗堿對腫瘤細胞周期的阻滯作用和對周期進展關(guān)鍵蛋白Cyclin D1的抑制作用的基礎(chǔ)上，研究其對Cyclin D1相關(guān)信號通路的作用，探討小檗堿抑制Cyclin D1轉(zhuǎn)錄的分子機制，為闡明小檗堿阻滯腫瘤細胞周期進展、抑制腫瘤細胞增殖的作用機理提供實驗依據(jù)，并為小檗堿抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 第一部分：研究小檗堿對人高轉(zhuǎn)移性肺癌PG細胞周期進展和Cyclin D1表達的影響。 1．培養(yǎng)人高轉(zhuǎn)移性肺癌PG細胞，采用MTT

3、法檢測小檗堿對PG細胞增殖的作用。與對照組相比，經(jīng)不同濃度(10μg/ml，2μg/ml，40μg/ml)的小檗堿處理24小時和48小時，PG細胞生長明顯受到抑制。 2．流式細胞儀檢測小檗堿對PG細胞周期進展的影響，結(jié)果表明，小檗堿可使G0/G1期細胞增多，而S期和G2/M期細胞減少，與對照組相比有顯著差異(P<0.01)；小檗堿高低劑量組間有明顯差異(P<0.05)。 3．RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度小檗堿處理后2

4、4小時，PG細胞Cyclin D1的mRNA水平較對照組明顯降低。小檗堿對PG細胞Cyclin D1的表達有抑制作用。 第二部分：研究小檗堿對PG細胞Cyclin D1相關(guān)信號通路的作用。在確定小檗堿對腫瘤細胞周期的阻滯作用和對周期進展關(guān)鍵蛋白Cyclin D1的抑制作用的基礎(chǔ)上，研究其對Cyclin D1相關(guān)信號通路的作用，探討小檗堿抑制Cyclin D1轉(zhuǎn)錄的分子機制。 1．雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，小檗堿對PG細

5、胞AP-1，Wnt信號通路活性有明顯抑制作用，而對NF-кB信號通路影響不明顯。進一步實驗表明，經(jīng)PDB+Ionomysin處理的PG細胞AP-1信號通路被激活，小檗堿能有效抑制這種激活，其作用呈劑量依賴性。 2．Western Blot檢測表明，經(jīng)不同濃度小檗堿處理后，PG細胞內(nèi)與Cyclin D1轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)的AP-1轉(zhuǎn)錄因子組分c-Jun蛋白含量明顯降低，降低的水平與小檗堿濃度相關(guān)。 3．EMSA結(jié)果顯示，不同濃度

6、的小檗堿均能抑制PG細胞核提取物與帶有野生型AP-1位點的寡核苷酸結(jié)合；經(jīng)小檗堿處理后PG細胞核提取物與Cvclin D1上游啟動子區(qū)帶有AP-1位點的寡核苷酸結(jié)合減少。實驗結(jié)果提示： 1．小檗堿通過抑制周期進展關(guān)鍵蛋白Cvclin D1，阻滯PG細胞周期進展，從而抑制PG細胞增殖。 2．小檗堿對Cyclin D1相關(guān)信號通路AP-1和Wnt的活性具有抑制作用，對NF-кB通路活性影響不明顯。小檗堿對異常激活的AP-1信