MASP-2 EGF和SP功能區(qū)抗體制備及初步鑒定.pdf

1、近年來，關(guān)于天然免疫識別學說——模式識別理論的提出推動了免疫學的發(fā)展。模式識別受體-病原體相關(guān)分子模式(PRR-PAMP)的研究引起高度關(guān)注。甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)是重要的PRR之一，在固有免疫中扮演重要角色。當MBL識別病原體時，其下游的蛋白酶MASP-2(mannose-binding lectin associated serine protease-2)通過裂解絲氨酸蛋白酶域N端的精氨酸-異亮氨酸間的肽鍵發(fā)生自激活作用，在

2、補體激活的凝集素途徑中發(fā)揮重要作用。另有研究表明，MASP-2與腫瘤，感染性疾病和自身免疫性疾病有關(guān)。因此，對MASP-2的研究已成為研究天然免疫的熱點之一。MASP-2由6個功能區(qū)組成，其中EGF功能區(qū)含Ca2+結(jié)合模體，SP功能區(qū)具有較高的激活凝血酶能力，參與MASP-2的自激活。本課題擬在構(gòu)建構(gòu)建MASP-2 EGF和SP原核表達載體重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，在異丙基硫代半乳糖苷的作用下進一步誘導(dǎo)表達蛋白，純化后免疫小鼠制備多克隆抗體，以

3、期為為后續(xù)檢測體液MASP-2含量、分析不同細胞MASP-2表達情況奠定基礎(chǔ)。
　　首先從胎肝提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后以此為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴增得到特異性EGF、SP基因，采用酚-氯仿抽提法提純PCR產(chǎn)物，對EGF、SP片段和pGEX-6p-2質(zhì)粒進行BamH(I)、Not(I)雙酶切，凝膠回收各片段，以T4 DNA連接酶分別連接EGF和SP片段酶切產(chǎn)物與pGEX-6P-2載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。采用熱休克法分別將EGF、

4、SP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化導(dǎo)入E.coli BL21感受態(tài)細菌，轉(zhuǎn)化后菌液直接涂布于LB固體選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。采用針對pGEX-6p-2質(zhì)粒通用引物的菌落PCR初篩LB平板上生長的單克隆菌落，將陽性擴增的單克隆接種于LB液體選擇培養(yǎng)液震蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒為模板，以載體通用引物分別和EGF、SP目的片段的特異引物進行cross-PCR鑒定，并同時進行amH(I)、Not(I)雙酶切鑒定。Cross-PCR擴增陽性和雙酶切鑒定均正確的質(zhì)粒進行DN

5、A序列測定鑒定重組質(zhì)粒正確性。序列測定結(jié)果與GenBank公布的masp-2EGF和SP標準序列比對完全一致，且沒有發(fā)現(xiàn)移碼現(xiàn)象，說明成功構(gòu)建pGEX-6P-2-EGF、pGEX-6P-2-SP原核表達重組體。
　　確定重組表達載體成功構(gòu)建后，轉(zhuǎn)化pGEX-6P-2-EGF和pGEX-6P-2-SP重組載體于E.coli BL21感受態(tài)細菌，將菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后挑取單個菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜;次日擴大培

6、養(yǎng)一定時間加IPTG誘導(dǎo)表達，低溫離心并洗滌菌體沉淀后，再次低溫離心棄上清收集菌體;超聲裂解所獲菌體，分別收集上清和沉淀，制樣進行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍染色后分析蛋白表達形式，GST-EGF融合蛋白在上清表達，為可溶性蛋白;而SP融合蛋白只以包涵體形式存在，經(jīng)尿素處理后，純化GST-EGF和GST-SP融合蛋白。
　　最后分別用純化的GST-EGF和GST-SP融合蛋白免疫6～7周齡BALB/c小鼠，免疫完成后取小鼠血清

7、分別檢測其抗體特異性和效價。大量誘導(dǎo)GST-EGF和GST-SP融合蛋白，分別于第0、21、35天對小鼠進行三次腹腔注射免疫，并設(shè)置對照組，末次免疫7天后取血，分離并保存血清，Western blotting檢測血清EGF、SP抗體特異性，間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清中EGF、SP抗體水平;EGF鼠抗血清效價達1∶32000，SP鼠抗血清效價達1∶40000，WB結(jié)果顯示融合蛋白組小鼠血清稀釋1000倍后仍有特異性目的條