腎臟急性缺血再灌注損傷的代謝組學研究.pdf

1、急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是指由導致腎臟結(jié)構(gòu)或功能變化的損傷引起的腎功能突然(48小時以內(nèi))下降,是心臟、大血管、肝移植等外科手術、膿毒血癥及ICU重癥患者的常見并發(fā)癥,亦可由常見醫(yī)療干預(造影劑、氨基糖甙類抗生素、非甾體類抗炎藥等)引起,基于住院患者的流行病學調(diào)查顯示其發(fā)病率可達7.2％,其中有慢性腎臟病基礎的患者發(fā)病率更可高達15.7％,社區(qū)獲得性ARF的患病率也達到0.4％,其進展嚴重影響患者生存

2、質(zhì)量及預后。AKI的臨床診療中,存在診斷和治療的雙重缺陷,首先,診斷主要依靠血肌酐和尿量,但是,血肌酐并不是一個敏感的指標,而且血肌酐和尿量都容易受腎功能以外多種因素的影響；治療方面,血液透析技術是目前對重癥急性腎損傷最重要的治療措施之一,缺乏有效的針對病因的治療干預,患者預后不佳。因此,探明急性腎損傷的發(fā)病機制并尋找早期預防措施己成為腎臟病及急救醫(yī)學領域的前沿課題之一。代謝組學是在細胞、組織或器官新陳代謝的動態(tài)進程中,研究所有代謝組分

3、尤其指小分子物質(zhì)的變化規(guī)律的一門新興科學。由于代謝(物)處于生物系統(tǒng)生化活動調(diào)控的末端,包含著反映生理表型的直接而全面的生物標記物(biomarker)信息,因此,代謝組學日益成為整體性研究生命體系功能變化的非常有力的分析手段。 臨床流行病學研究發(fā)現(xiàn),各種原因引起的灌注不足是急性腎損傷最常見的病,因此本研究首先建立AKI的急性缺血再灌注損傷大鼠模型。采用夾閉雙側(cè)腎動脈45分鐘的方法造成缺血再灌注損傷,收集大鼠術前及術后不同時間點

4、血清和術后1、2、3、4天的24小時尿液。大鼠術后全部存活,腎功能迅速下降,尿量增多,腎臟增大,腎重/體重增加,組織學表現(xiàn)出急性腎小管壞死,符合腎臟急性缺血再灌注損傷的表現(xiàn)。與以往一側(cè)腎切除、一側(cè)腎缺血及結(jié)扎雙側(cè)腎蒂的造模方法相比,雙側(cè)腎動脈夾閉的缺血再灌注損傷模型無腎臟切除帶來的神經(jīng)內(nèi)分泌影響,僅為動脈缺血而無靜脈、輸尿管阻塞,更能模擬臨床因外科手術、心衰、肝硬化等造成的腎臟低灌注情況。 在成功制造急性腎臟缺血再灌注損傷動物模

5、型的基礎上,本研究采用RRLC/Q-TOF-MS對動物血清標本就行了代謝產(chǎn)物的檢測。應用快速分辨率液相色譜RRLC 1200,C18 XDB色譜柱(2.1mm×100mm,1.8μm,美國Agilen公司)進行高效液相色譜分析,6510 Q-TOF質(zhì)譜正離子模式進行代謝物的鑒定。RRLC/MS在血清中檢測到大量代謝產(chǎn)物,每個樣本檢測到的特征(-對質(zhì)量數(shù)和保留時間,代表一種物質(zhì))都在1500個以上,應用主成份分析法(principle c

6、omponentanalysis,PCA)和偏最小二乘法-判別分析(Partial Least Squares-Discriminanlanalysis,PLS-DA)進行多元統(tǒng)計分析,產(chǎn)生得分圖(score plot)和載荷圖(loadingplot),其中得分圖顯示,在各個時間點得分圖中,缺血再灌注組和對照組能夠完全分開,術后2小時,缺血再灌注和對照組即有明顯不同,早于血清肌酐和尿素氮的變化,表明代謝組學的圖形識別技術可以早期診斷急

7、性腎損傷。 對圖形區(qū)分產(chǎn)生貢獻的物質(zhì)組成載荷圖,檢索Metlin數(shù)據(jù)庫對這些物質(zhì)進行鑒定,發(fā)現(xiàn)對區(qū)分缺血再灌注組和對照組貢獻最大的物質(zhì)主要有兩類：(1)磷脂酰膽堿類分解代謝產(chǎn)物,這類物質(zhì)在缺血再灌注動物血清中的含量有不同程度的增高,提示在該組動物組織內(nèi)磷脂酶的激活；(2)卡尼汀及其衍生物：缺血再灌注動物血清中,卡尼汀及短鏈脂?？嵬舛冉档?而棕櫚?？嵬舛仍龈?提示在缺血再灌注過程中,卡尼汀消耗增加,且存在內(nèi)源性卡尼汀的不足

8、。 在此基礎上,本文用大劑量的左旋卡尼汀對急性缺血再灌注損傷進行干預,實驗分三個內(nèi)容：第一,預防性給予左旋卡尼汀能否有效保護腎臟缺血再灌注損傷；第二,探討缺血再灌注損傷保護的機制；第三,再灌注后延遲給予左旋卡尼汀是否有保護作用。結(jié)果表明在術前預防性給藥或在再灌注開始時給藥可成功保護腎臟急性缺血再灌注損傷,大鼠術后多尿現(xiàn)象改善,血清肌酐、尿素氮較手術組顯著降低,腎臟水腫淤血現(xiàn)象改善,小管壞死評分顯著降低,TUNEL陽性染色細胞數(shù)目

9、降低。進一步探討其機制發(fā)現(xiàn),早期給予左旋卡尼汀可防止Bax轉(zhuǎn)位至線粒體,增加線粒體Bcl-2與線粒體外膜的聯(lián)系,減少線粒體細胞色素C的釋放,并可防止線粒體膜電位的下降,表明左旋卡尼汀對腎臟的保護作用可能與其降低線粒體膜通透性有關。 綜上,本研究發(fā)現(xiàn),代謝組學能夠在2-72小時的各個時間點區(qū)分對照組和缺血再灌注損傷組血清,代謝物譜能夠早于血清肌酐、尿素氮的變化而發(fā)現(xiàn)腎臟損傷；差異代謝產(chǎn)物主要有磷脂酰膽堿分解代謝產(chǎn)物,卡尼汀及其衍生