創(chuàng)傷弧菌溶細胞素基因vvhA原核表達載體的構建及其蛋白質致炎、應激作用的初探.pdf

1、構建pET28a(+)-vvhA融合基因原核表達載體,分離純化融合蛋白VVC,并對其進行蛋白質復性和多克隆抗體制備.觀察經(jīng)有活性的融合蛋白VVC作用肝癌細胞后,肝癌細胞的TNF-α、HSP90和IL-10因子的表達情況,為進一步研究其生物物學作用奠定基礎. 方法：1、pET28a(+)-vvhA融合基因原核表達載體的構建、表達與純化利用PCR方法,以含vvhA基因的克隆質粒為模板,擴增融合基因vvhA并將其亞克隆入原核表達載體p

2、ET28a(+)中,構建成表達載體pET28a(+)-vvhA,限制性內切酶雙酶切和測序鑒定質粒構建是否正確.將表達質粒轉化E.coli BL21(DE3),IPTG誘導其表達,SDS-PAGE和免疫印跡分析表達產(chǎn)物.將以包涵體形式表達的蛋白質,用洗滌液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ進行洗滌后,以Ni-NTA親合層析法純化VVC融合蛋白,SDS-PAGE和免疫印跡分析純化產(chǎn)物.2、VVC融合蛋白的復性和多克隆抗體的制備將純化目的蛋白分別用PBS液透析復性、

3、柱上復性和加入不同濃度的鹽酸胍、鹽離子、助溶劑、氧化還原電勢、沉淀劑、離子鰲合劑和不同濃度的緩沖液組成的16種不同復性液進行蛋白質復性對比.選出幾種復性率較高的復性方法.利用復性純化蛋白質作用新鮮兔紅細胞懸液,觀察細胞溶血情況來評價復性效果.用純化目的蛋白免疫日本大耳兔制備多克隆抗體,免疫印跡分析重組蛋白的免疫原性并用ELISA檢測多克隆抗體的效價.3、體外實驗對復性純化蛋白的生物學活性進行初探將復性純化蛋白作用于Hep2細胞,觀察細胞

4、的損傷情況,進一步印證復性效果.作用于人肝癌細胞株(SMMC7721),利用RT-PCR方法,檢測TNF-α、HSP90、IL-10 mRNA動態(tài)變化,來初步評價VVC融合蛋白的生物學活性. 結果： 1、原核表達載體的構建、表達與純化雙酶切及測序結果表明原核表達載體pET28a(+)-vvhA與設計相符.工程菌BL21 DE3<'Pet28(a+)-vvhA>誘導表達后可在54Kda處產(chǎn)生特異性表達條帶,能被抗His<,

5、6>單克隆抗體特異性識別.表達蛋白質經(jīng)三步洗滌后,再經(jīng)Ni-NTA柱純化,其純度達96﹪以上.免疫印跡分析表明,純化后的蛋白能被抗His<,6>單克隆抗體特異性識別. 2、VVC融合蛋白的復性和多克隆抗體的制備純化的重組蛋白包涵體經(jīng)16種不同復性液復性,均不同程度得到復性.其復性率最高可接近20﹪.同時重組蛋白包涵體利用PBS液進行復性得率卻極低,但利用純化柱進行柱上復性,其復性率卻高達97﹪以上.免疫印跡分析證實,兔抗VVC融

6、合蛋白多克隆抗體能與重組蛋白發(fā)牛特異性反應,ELISA檢測其效價為1:25 600. 3、體外實驗對復性純化蛋白生物牛物學活性進行初探細胞增殖實驗結果顯示,兔抗VVC融合蛋白多克隆抗體能明顯阻斷VVC融合蛋白損傷細胞作用.TNF-α、HSP90和IL-10 mRNA結果顯示,VVC融合蛋白能明顯誘導肝癌細胞(SMMC7721)上調TNF-α、HSP90和下調IL-10分泌的能力,但具有時間和劑量依賴性. 結論：