冬凌草甲素及其納米混懸劑對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1作用的比較研究.pdf

1、胰腺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,發(fā)病率占人類(lèi)全身腫瘤的1％～3％,消化道腫瘤的8％～10％。其惡性程度高,難于早期診斷。目前外科手術(shù)是根治胰腺癌的唯一方法,但在胰腺癌患者中,僅約20％可行手術(shù)治療,而接受根治性手術(shù)患者的5年生存率僅20％～25％,80％無(wú)法手術(shù)或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者2年生存率為5％～18％,5年生存率為0～5％。因此,輔助治療尤其是化學(xué)治療(化療)對(duì)于改善進(jìn)展期胰腺癌患者的生活質(zhì)量極為重要.同時(shí)在一定條件下可延長(zhǎng)生存期,

2、并可能贏得手術(shù)機(jī)會(huì)。
　　 冬凌草甲素(oridonin)是從唇形科(Labtea)香茶菜屬(Rabdosia)植物中分離出的一種貝殼杉烯二萜類(lèi)(ent-kaurene diterpenoid)天然有機(jī)化合物。研究發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖和促凋亡作用。但由于其水溶性差,吸收率低,體內(nèi)生物半衰期短,目前有關(guān)制劑的臨床抗癌療效尚不理想。因此如何增加冬凌草甲素的水溶性、提高其生物利用度是亟待解決

3、的問(wèn)題。
　　 納米混懸劑是適用于難溶性藥物的新劑型,系將藥物顆粒粉碎到納米級(jí)后懸浮于分散介質(zhì)中。其優(yōu)點(diǎn)是增加了藥物的溶解性并最終提高了藥物的釋放速率。與傳統(tǒng)意義上的基質(zhì)骨架型納米體系不同,納米混懸劑無(wú)需載體材料,有效避免了共溶劑的毒副作用以及環(huán)糊精對(duì)藥物分子大小的要求。納米混懸劑還能產(chǎn)生生物粘附性,增加藥物穩(wěn)定性從而提高藥效。
　　 本課題研究了冬凌草甲素原料藥及其納米混懸劑對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖和凋亡的影響及

4、其作用機(jī)制,進(jìn)一步分析比較冬凌草甲素原料藥及其納米混懸劑作用效果的差異,以評(píng)價(jià)冬凌草甲素抗胰腺癌的效果以及冬凌草甲素納米混懸劑的應(yīng)用價(jià)值。研究結(jié)果為臨床藥物劑型的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)對(duì)促進(jìn)中藥現(xiàn)代化的發(fā)展也具有重要意義。
　　 第一部分
　　 冬凌草甲素及其納米混懸劑對(duì)PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用
　　 [研究目的]檢測(cè)并比較冬凌草甲素及其納米混懸劑對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖的抑制作用
　　 [研究

5、方法]
　　 (1)光學(xué)顯微鏡觀察不同濃度冬凌草甲素及其納米混懸劑對(duì)PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　 (2)MTT試驗(yàn)檢測(cè)冬凌草甲素及其納米混懸劑對(duì)PANC-1細(xì)胞存活率的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)光學(xué)顯微鏡觀察可見(jiàn),細(xì)胞在形態(tài)上的變化,細(xì)胞變圓皺縮,并且隨著冬凌草甲素濃度的增加,細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。
　　 (2)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率都隨給藥濃度的增加和用藥時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升

6、高,呈明顯的劑量和時(shí)問(wèn)依賴(lài)性。在相同用藥濃度下,冬凌草甲素納米混懸劑對(duì)PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用效果更好。
　　 [結(jié)論]冬凌草甲素及其納米混懸劑對(duì)PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用,并且其混懸劑的抑制效果更明顯。
　　 第二部分
　　 冬凌草甲素及其納米混懸劑對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡的影響
　　 [研究目的]檢測(cè)比較冬凌草甲素及其納米混懸劑對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡的影響,探討凋亡機(jī)制。
　　 [研

7、究方法]
　　 (1)碘化丙啶(PI)染色和Hoechst33342染色法觀察不同濃度冬凌草甲素及其納米混懸劑作用于PANC-1細(xì)胞后,細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
　　 (2)膜聯(lián)蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)／PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不同濃度冬凌草甲素及其納米混懸劑對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡的影響。
　　 (3)分光光度法檢測(cè)冬凌草甲素及其納米混懸劑分別作用于PANC-1細(xì)胞不同時(shí)間后,Caspase-3酶活性的變化。
　

8、　 (4)Western blot法測(cè)定Caspase-3酶原(pro-caspase-3)、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)變化。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)PI染色和Hoechst33342染色結(jié)果顯示,冬凌草甲素及其納米混懸劑均能誘導(dǎo)PANC1細(xì)胞凋亡。
　　 (2)冬凌草甲素及其納米混懸劑對(duì)PANC-1細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用,細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度的增加而逐漸增加,冬凌草甲素納米混懸劑組的凋亡率更高。

9、r>　　 (3)Caspase-3酶活性檢測(cè)顯示,冬凌草甲素及其納米混懸劑作用于細(xì)胞后Caspase-3活性較對(duì)照組顯著增強(qiáng)。
　　 (4)Western blot結(jié)果顯示Caspase-3酶原被激活,Bax的表達(dá)增加,Bcl-2的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 [結(jié)論]冬凌草甲素及其納米混懸劑均能誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞發(fā)生凋亡,并且納米混懸劑具有更好的誘導(dǎo)凋亡作用。其機(jī)制可能是通過(guò)改變Bax／Bcl-2的表達(dá),繼而啟動(dòng)casp

10、ase途徑誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 第三部分
　　 冬凌草甲素及其納米混懸劑對(duì)PANC-1細(xì)胞周期的影響
　　 [研究目的]檢測(cè)比較冬凌草甲素及其納米混懸劑對(duì)PANC-1細(xì)胞周期分布的影響,探討其影響細(xì)胞周期分布的機(jī)制。
　　 [研究方法]
　　 (1)PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度冬凌草甲素及其納米混懸劑對(duì)PANC-1細(xì)胞周期分布的影響。
　　 (2)Western Blot

11、檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinB1、Cdc2和p-cdc2(T161)的表達(dá)變化。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)冬凌草甲素及其納米混懸劑均可將PANC-1細(xì)胞周期阻滯在G2／M期,且納米混懸劑的阻滯作用更強(qiáng)。
　　 (2)CyclinB1和p-cdc2(T161)的表達(dá)隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而減少,Cdc2的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 [結(jié)論]冬凌草甲素及其納米混懸劑均能夠抑制CyclinB1和p-ode2(

12、T161)的表達(dá),使PANC-1細(xì)胞周期阻滯在G2／M期。
　　 上述三部分研究結(jié)果顯示,冬凌草甲素及其納米混懸劑均可通過(guò)G2／M細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1的生長(zhǎng),且納米混懸劑的作用更明顯。其促凋亡作用分子機(jī)制可能是通過(guò)改變Bax／Bcl-2的表達(dá)比率,激活Caspase-3,從而促進(jìn)PANC-1細(xì)胞發(fā)生凋亡；G2／M細(xì)胞周期阻滯可能是通過(guò)降低CyclinB1和p-cdc2(T161)的表達(dá)而發(fā)揮作用的。<