剛地弓形蟲14-3-3蛋白真核表達載體的構建與表達.pdf

1、剛地弓形蟲是一種呈世界性分布的重要機會性致病原蟲，專性寄生細胞內，人與動物均能感染，引起人獸共患弓形蟲病。正常情況下，宿主感染弓形蟲后，呈隱性狀態(tài)。但在宿主免疫功能低下時，如器官移植、AIDS、惡性腫瘤等患者，弓形蟲可引起器官損害，導致嚴重后果。孕婦感染弓形蟲可致流產、死產和早產，存活者也?；加谢魏椭橇φ系K等嚴重后遺癥。除感染人外，弓形蟲也可感染家畜，引起羊等多種家畜的流產和大量死亡，給全世界的畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失和影響其發(fā)展。

2、同時，帶蟲家畜是人感染弓形蟲的主要傳染源。
　　 近年來，在真核細胞內信號傳導通路研究中，發(fā)現(xiàn)了一組關鍵信號蛋白14-3-3蛋白家族。14-3-3蛋白是廣泛存在于植物、酵母、原蟲、蠕蟲、昆蟲和包括人在內的多種動物真核細胞內的一種高度保守蛋白。它參與很多細胞正常生命活動的調節(jié)。據(jù)資料推測，14-3-3蛋白也可能在弓形蟲細胞信號轉導中起重要的調節(jié)作用。
　　 目的:構建剛地弓形蟲RH株14-3-3蛋白的真核表達載體，并在真核

3、細胞內表達該載體，為研究弓形蟲中此蛋白的功能奠定基礎。
　　 方法:首先利用生物信息學方法對弓形蟲14-3-3蛋白的理化性質和結構進行預測。用基因工程的方法，以弓形蟲RH株總RNA為模板，逆轉錄PCR(RT-PCR)擴增目的基因片段。與pEASY-T1克隆載體連接，篩選出陽性克隆，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后，亞克隆至真核表達載體pEGFP-C1。經(jīng)過PCR、雙酶切和測序鑒定后，將構建好的真核表達載體pEGFP/14-3-3轉染HEK

4、293細胞，用熒光顯微鏡觀察其在HEK293細胞內表達情況，Western-blot鑒定表達產物。
　　 結果:預測14-3-3蛋白分子為酸性可溶性蛋白。14-3-3二級結構由Alphahelix(Hh)、Extended strand(E)e及Random coil(Cc)組成。3D結構顯示14-3-3蛋白主要以同源或異源二聚體存在，形成一個U型結構。14-3-3單體是由9個反向平行的α螺旋(Hh)構成。發(fā)現(xiàn)約5個氨基酸保守序

5、列區(qū)，與結構和功能相關的位點高度保守。RT-PCR擴增出的基因片段約800bp，構建的真核表達質粒pEGFP/14-3-3經(jīng)PCR、雙酶切鑒定正確。測序結果表明，其具有一個801bp完整的開放閱讀框，與GenBank中剛地弓形蟲14-3-3蛋白基因序列(登錄號為AB012775.1)同源性為99％。熒光顯微鏡下觀察到重組質粒能夠在HEK293細胞中表達。Western-blot分析結果顯示，在轉染pEGFP/14-3-3重組質粒的細胞中