馬兜鈴酸Ⅰ以及CD40信號(hào)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響.pdf

1、研究背景： 馬兜鈴酸(Aristolochic acid，AA)是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物中的一類(lèi)菲類(lèi)化合物，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能和提升白細(xì)胞等作用，因而廣泛用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、毒蛇咬傷和創(chuàng)口化膿。90年代開(kāi)始，因服用含AA的藥物所致的“馬兜鈴酸腎病”(aristolochic acid nephropathy，AAN)在國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)界受到了廣泛的關(guān)注。不同劑量、不同作用時(shí)間的AA可引起腎小管上皮細(xì)胞(RTECs)出現(xiàn)不同程度和不

2、同類(lèi)型的結(jié)構(gòu)改變。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明，AA引起的腎損害可能涉及腎小管上皮細(xì)胞損傷、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生或活性增高、腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、RTECs轉(zhuǎn)分化及肌成纖維細(xì)胞(MyoF)聚集以致腎間質(zhì)纖維化。目前對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷參與慢性腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程的研究較多，但馬兜鈴酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用目前報(bào)道較少。 目的： 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用馬兜鈴酸I作用于體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，觀察馬兜鈴酸I對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡、分泌、轉(zhuǎn)化

3、方面的影響。 方法： 1)MTT比色法：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)的HUVEC接種到96孔板，加入不同濃度(10、20、40、80μg/ml)的馬兜鈴酸I刺激72小時(shí)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，檢測(cè)馬兜鈴酸I對(duì)HUVEC增殖的影響。 2)流式細(xì)胞儀：將HUVEC經(jīng)不同濃度(20、40、80μg/ml)的馬兜鈴酸I刺激72小時(shí)，檢測(cè)馬兜鈴酸I對(duì)HUVEC凋亡的影響。 3)酶聯(lián)免疫法：將HUVEC經(jīng)不同濃度(20、40、80μ

4、g/ml)的馬兜鈴酸1分別刺激一、二、三、四、五天，檢測(cè)馬兜鈴酸I引起HUVEC分泌TGF-β1的變化：激發(fā)型CD40單抗5C11經(jīng)不同濃度(2.5、5.0、10μg/ml)刺激HUVEC一、二、三、四、五天，檢測(cè)上清液中TGF-β1的變化。4)細(xì)胞免疫組化：將HUVEC經(jīng)40μg/ml的馬兜鈴酸I刺激72h，細(xì)胞免疫組化的方法測(cè)定F1k-1和α-SMA的表達(dá)，觀察內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的情況。 結(jié)果： 1)馬兜鈴酸I刺激72h后

5、，10μg/ml組和20μg/ml組細(xì)胞增殖未受抑制，40μg/ml組可見(jiàn)細(xì)胞增殖受到抑制，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，80μg/ml組細(xì)胞增殖明顯受到抑制，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2)馬兜鈴酸I在20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml時(shí)均可引起HUVEC明顯的凋亡。 3)馬兜鈴酸I在20μg/ml濃度時(shí)，可明顯促進(jìn)TGF-β1的分泌，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而40μg/ml組和80μg/ml組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、意義。 4)5C11刺激后HUVEC分泌TGF-β1明顯增加，其中2.5μg/ml濃度刺激TGF-β1分泌的增加顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5)經(jīng)馬兜鈴酸I40μg/ml刺激后，未見(jiàn)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子Flk-1的表達(dá)下調(diào)和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記分子α-SMA的表達(dá)上調(diào)。 討論： 腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與腎小管問(wèn)質(zhì)纖維化的關(guān)系是近幾年研究的熱點(diǎn)。本研究即采用體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，馬兜鈴酸I刺激后細(xì)胞的增殖和