MⅡP抑制子宮內膜癌轉移及其機制研究.pdf

1、子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）是最常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。侵襲、轉移是EC患者死亡的主要原因。因此，抑制侵襲轉移是提高EC患者生存率的關鍵。遷移侵襲抑制蛋白（Migration and InvasionInhibitory Protein，MIIP）基因為新發(fā)現(xiàn)的候選腫瘤轉移侵襲抑制基因，定位于1p36，該區(qū)域在包括EC在內的多種腫瘤中缺失。MIIP的定位提示其可能在EC的侵襲、轉移中

2、發(fā)揮作用，但關于MIIP與EC的研究，國內外尚未見報道。本研究首先檢測MIIP在人正常子宮內膜、EC組織中的表達，若發(fā)現(xiàn)MIIP的缺失與EC轉移有關，則通過體外試驗進一步探討MIIP是否可抑制EC細胞的增殖、遷移及侵襲。若MIIP抑制EC細胞的遷移及侵襲，則進一步從形態(tài)學及功能學兩方面探討MIIP抑制EC細胞遷移及侵襲的機制。由于肌動蛋白細胞骨架重組（包括應力纖維及板狀偽足）是腫瘤細胞發(fā)生轉移的基礎，Rho GTPases可調節(jié)肌動蛋白

3、骨架重組，因此本研究將探討MIIP是否通過Rho GTPases信號傳導通路（包括與應力纖維形成有關的Rho/Rock1信號傳導通路及與板狀偽足形成有關的Racl/PAK1信號傳導通路）抑制EC細胞的遷移及侵襲。
　　 一、MIIP蛋白表達與子宮內膜癌生物學行為的研究
　　 目的：探討MIIP在正常子宮內膜及EC組織中的表達水平及其與EC臨床病理特征的關系。
　　 方法：Westernblot檢測MIIP在正常子

4、宮內膜及EC組織中的表達。
　　 結果：EC組織中MIIP表達水平顯著低于正常子宮內膜。高分化EC患者MIIP表達水平明顯高于中、低分化者；FIGOⅠ+Ⅱ期MIIP表達水平明顯高于Ⅲ+Ⅳ期患者。無淋巴結轉移患者MIIP表達水平顯著高于有淋巴結轉移者。
　　 結論：MIIP的失表達可能與EC的發(fā)生、發(fā)展有關。MIIP的失表達與EC不良病理特征（低分化、晚期及淋巴結轉移）有關，提示預后不良。
　　 二、MIIP對子宮

5、內膜癌細胞增殖以及遷移、侵襲的影響
　　 目的：探討MIIP基因對EC細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。
　　 方法：Western blot檢測MIIP在EC細胞株AN3CA、ECC-1、Ishikawa、HEC1A及HEC1B中的表達。Si-RNA及Ad-MIIP分別下調及上調EC細胞MIIP表達。MTT檢測MIIP下調/上調后MIIP對EC細胞增殖的影響，平板克隆形成試驗檢測pcDNA3.1-MIIP及pcDNA3.

6、1-control轉染后MIIP對EC細胞增殖的影響。劃痕損傷實驗檢測MIIP下調/上調對細胞遷移能力的影響。Transwell轉移、侵襲實驗檢測MIIP下調/上調前后對EC細胞遷移、侵襲能力的影響。
　　 結果：各細胞株中，HEC1A細胞MIIP表達水平相對較高，Si-RNA能使HEC1A細胞中MIIP表達水顯著下降；MIIP在AN3CA及HEClB細胞株中幾乎不可見，Ad-MIIP感染后，AN3CA及HEC1B細胞中MIIP

7、表達水平明顯上升。MTT結果顯示72h內，MIIP可抑制EC細胞的增殖，但與對照組的差異無統(tǒng)計學意義。轉染pcDNA3.1-control質粒組HEC1A及HEC1B細胞形成克隆數(shù)量多，體積較大，轉染pcDNA3.1-MIIP質粒組細胞形成克隆數(shù)少，體積較小。HEC1A細胞MIIP下調后，與對照組相比，劃痕損傷試驗顯示細胞遷移能力明顯增加，在Transwell遷移培養(yǎng)體系中，穿膜細胞數(shù)明顯增加；反之，AN3CA及HEClB細胞MIIP上

8、調后，與對照組相比，劃痕損傷試驗顯示細胞遷移能力明顯減低，Transwell遷移實驗顯示穿膜細胞數(shù)明顯減低。同時，用Transwell侵襲培養(yǎng)體系，也得到了與Transwell遷移培養(yǎng)體系相似的結果，即HEC1A細胞MIIP下調后，穿膜細胞數(shù)也較對照組明顯增加；HEC1B細胞MIIP上調后，穿膜細胞數(shù)較對照組明顯減低。
　　 結論：MIIP可抑制EC細胞的增殖。MIIP高表達的HEC1A細胞中的MIIP被下調后，細胞遷移、侵襲能

9、力明顯增加；MIIP低表達的HEC1B，AN3CA細胞在上調MIIP表達后，遷移、侵襲能力明顯下降。因此，MIIP基因可抑制EC細胞的遷移、侵襲。
　　 三、MIIP通過阻滯Rho/Rock1信號傳導通路抑制子宮內膜癌細胞遷移
　　 目的：探討MIIP是否通過阻滯Rho/Rock1信號傳導通路而影響應力纖維的形成，進而抑制EC細胞遷移、侵襲。
　　 方法：F-actin免疫熒光染色觀察MIIP上調/下調前后細胞形

10、態(tài)改變。GTPRho pulldown試驗檢測MIIP對Rho活性的影響。免疫共沉淀檢測MIIP是否可與Rho下游作用因子Rock1結合。HEC1B細胞共轉染CA-RhoA-GFP+MIIP/pDsRed（實驗組）或CA-RhoA-GFP+pDsRed（對照組），檢測MIIP對RhoA定位及功能的影響。
　　 結果： MIIP上調使細胞內中心應力纖維明顯減少，且大部分應力纖維位于細胞邊緣區(qū)域。反之，MIIP下調可使中心應力纖維較

11、對照組明顯增多。MIIP上調可使沉淀下來的活性形式的RhoA明顯減低：MIIP下調可使沉淀下來的活性形式的RhoA明顯升高。免疫共沉淀顯示MIIP可與Rho下游作用因子Rock1結合。HEC1B細胞共轉染后：對照組細胞顯示腫瘤細胞遷移的形態(tài)學改變，細胞尾部收縮，RhoA聚集于細胞尾部；然而MIIP的存在抑制了RhoA的功能，使尾部無法收縮而明顯延長，從而抑制了細胞的遷移。
　　 結論：MIIP在形態(tài)上可抑制應力纖維的形成，使細胞

12、尾部無法收縮，從而抑制了EC細胞的遷移。MIIP在功能上可能通過與RhoA競爭性結合其下游作用因子Rock1，阻滯了Rho信號傳導通路而抑制應力纖維形成。
　　 四、MIIP通過阻滯Rac1/PAK1信號傳導通路抑制子宮內膜癌細胞遷移
　　 目的：探討MIIP是否通過阻滯Rac1/PAk1信號傳導通路而影響與細胞遷移有關的板狀偽足的形成，進而抑制EC細胞遷移、侵襲。
　　 方法：F-actin免疫熒光染色觀察MI

13、IP上調/下調前后細胞形態(tài)學改變。GTPRac pulldown方法檢測MIIP對Rac活性的影響。免疫共沉淀檢測MIIP是否可與Racl下游作用因子PAK1結合。Rac1免疫熒光染色檢測MIIP對Rac1在細胞中定位的影響（Ad-vector為對照組，Ad-MIIP為實驗組）。
　　 結果：MIIP上調使板狀偽足較對照組明顯減少；MIIP下調使板狀偽足較對照組明顯增多。MIIP上調可使沉淀下來的活性形式的Rac1明顯減低；MI

14、IP下調可使沉淀下來的活性形式的Rac1明顯升高。免疫共沉淀顯示MIIP可與Rac1下游作用因子PAK1結合。HEC1B細胞MIIP上調后，Rac1聚集于細胞與細胞之間，而對照組Rac1位于移動細胞前緣促進細胞遷移。
　　 結論：MIIP在形態(tài)上可抑制細胞前緣板狀偽足的形成，減少細胞遷移的驅動力，從而抑制EC細胞的遷移。其機制可能是MIIP通過與Rac1競爭性結合其下游作用因子PAK1，阻滯了Rac1信號傳導通路而抑制板狀偽足的