2型糖尿病大鼠血管平滑肌細胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道電流的變化.pdf

1、目的:本實驗通過運用全細胞穿孔膜片鉗技術(shù)觀察2型糖尿病大鼠胸主動脈和腸系膜動脈血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(big conductance calcium activated potassium channel, BKca)的電流變化,探討B(tài)Kca與2型糖尿病血管病變之間的關(guān)系。方法:1.2型糖尿病大鼠模型的建立:雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后稱體重,隨機分為兩

2、組,對照組以普通飼料喂養(yǎng),高脂組喂以高脂高糖飼料。4周后高脂組SD大鼠腹腔一次性注射STZ25mg/kg(pH4.2的0.1mol/L枸櫞酸緩沖液配成0.25％濃度);對照組腹腔注射等體積的0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液。2.2型糖尿病大鼠模型的鑒定:于STZ注射一周后心臟采血測空腹血糖、血脂、血胰島素含量,成模鼠繼續(xù)高脂喂養(yǎng),于8、12周末分批用3％戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后,取胸主動脈及腸系膜小動脈供試驗用。3.膜片鉗

3、實驗:(1)細胞懸液制作:將分離的動脈剪切成碎片,置于細胞分離液中,37℃恒溫水浴振蕩,經(jīng)酶液兩步消化使細胞間質(zhì)及周圍的連接組織被酶解,然后將被消化后的動脈組織放于無鈣臺式液中,選取具有較強立體感表面光滑的平滑肌細胞,采用全細胞穿孔膜片鉗技術(shù)記錄電流。(2)全細胞穿孔膜片鉗步驟:在室溫下進行實驗,使微管電極尖端與周圍細胞間形成電化學(xué)絕緣,阻抗約10～100GΩ,形成全細胞構(gòu)型。用Clampex10.1軟件采集電流,Clampfit10.

4、1軟件系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析,統(tǒng)計電流幅值和制作I-V曲線。(3)單通道膜片鉗步驟:在形成全細胞構(gòu)型后,將電極尖端提出液面,再放回浴液中形成內(nèi)面向外式膜片;用pClamp9.0軟件記錄通道的電流信號。結(jié)果:1.通道的開放概率隨著電壓和單通道浴液中的Ca2+濃度的增加而增大。2.急性酶分離的大鼠胸主動脈VSMCs BKca電流的基本特性:(1) BKca宏觀電流具有明顯的電壓、鈣依賴性及外向整流的性質(zhì);(2)比較對照組、高脂組八周、高脂組十二周

5、BKca電流:對照組(n=8)、高脂八周組(n=6)、高脂十二周組(n=6)的電流幅值分別為352.31±82.56 pA(+60mV)、719.25±45.03 pA(+60 mV)、911.58±77.82 pA(+60 mV)。經(jīng)t檢驗,對照組與高脂八周組,t=9.785,P<0.05;正常組與高脂十二周組,t=12.845, P<0.05;高脂八周與高脂十二周組,t=5.240,P<0.05。3.急性酶分離的大鼠腸系膜動脈VSM

6、Cs BKca電流的基本特性:(1)BKca宏觀電流具有明顯的電壓、鈣依賴性及外向整流的性質(zhì);(2)比較對照組、高脂組八周、高脂組十二周BKca電流:對照組(n=5)、高脂八周組(n=5)、高脂十二周組(n=5)的電流分別為169.88±67.13 pA(+60mV)、330.41±55.04pA(+60 mV)、568.77±62.97pA(+60 mV)。經(jīng)t檢驗,對照組與高脂八周組,t=4.135, P<0.05;對照組與高脂十二