人神經生長因子成熟肽在昆蟲細胞中的表達和活性測定.pdf

1、神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是神經系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，兼有神經營養(yǎng)因子與促進神經突起生長雙重作用，對神經細胞的生長、發(fā)育、分化發(fā)揮調節(jié)作用，是參與損傷神經再生和功能修復的重要因子。同時，它還參與調節(jié)免疫和造血等非神經系統(tǒng)的功能。 NGF在人體組織中含量極微，已有報導從胎盤中純化hNGF，但其組織來源有限，成本高產量低，不能滿足對hNGF的需求。利用基因工程方法獲得有生物學活性的hNGF

2、制品，對其基礎理論研究和臨床應用具有重要的意義。Bac-to-Bac系統(tǒng)是一種新穎的桿狀病毒表達載體系統(tǒng)，構建及篩選重組病毒比傳統(tǒng)的桿狀病毒表達系統(tǒng)更為高效簡單快捷，業(yè)已成為研究真核基因表達較為理想的工具。 本實驗以帶有hNGF全長肽基因的重組質粒pFastBac-preproNGF為模板，擴增出成熟肽β-NGF基因片段。PCR產物經雙酶切后與經同樣雙酶切的轉移載體pFactBacl相連接，轉化DH5α細胞，構建重組轉移載體pF

3、astBac-pNGF并進行測序。測序結果正確后，提取該重組質粒轉化進入含有穿梭載體Bacmid的受體菌DH10Bac后發(fā)生轉座，得到含有hNGF成熟肽DNA的重組穿梭載體rBacmid-βNGF。再將這一重組穿梭載體轉染貼壁培養(yǎng)的昆蟲細胞Sf9，得到重組病毒rAcV-Bac-βNGF。經鑒定正確后進行昆蟲細胞Sf9的感染。分別將Sf9感染后培養(yǎng)上清和細胞總蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，結果顯示感染細胞總蛋白在14.6kDa，左右有