腺病毒介導靶向VEGFsiRNA對K562細胞凋亡及凋亡抑制基因survivin表達影響的研究.pdf

1、目的: 構建攜帶靶向血管內皮生長因子小干擾RNA（VEGF siRNA）的重組腺病毒質粒，收獲高滴度的重組腺病毒，為進一步研究提供載體工具。 方法: 采用定向克隆的方法將靶向VEGF siRNA插入穿梭質粒pSES-HUS，酶切及基因測序鑒定，命名為pSES-VEGFsi；采用同源重組方法將pSES-VEGFsi與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1連接，構建重組腺病毒質粒pAd5-VEGFsi。酶切鑒定pAd5-V

2、EGFsi，以脂質體介導法將其導入包裝細胞HEK293，熒光顯微鏡觀察pAd5-VEGFsi在細胞內包裝及擴增，通過乒乓感染并用氯化銫密度梯度離心法獲得高滴度的重組腺病毒Ad5-VEGFsi。 結果: （1）酶切及基因測序證實重組腺病毒質粒pAd5-VEGFsi構建成功。 （2）熒光顯微鏡證實重組腺病毒Ad5-VEGFsi成功導入HEK293包裝細胞，在細胞內得到良好表達。 （3）獲得了高滴度重組腺病毒A

3、d5-VEGFsi，病毒滴度約為4.6×1011pfu/ml。 結論: 成功構建了攜帶靶向VEGF siRNA的重組腺病毒質粒，并收獲高滴度重組腺病毒Ad5-VEGFsi，為進一步的研究打下了良好的基礎。 目的: 采用腺病毒介導VEGF siRNA（即攜帶VEGF siRNA的重組腺病毒）沉默白血病K562細胞中VEGF的表達，檢測K562細胞增殖及凋亡情況，并進一步檢測細胞內survlvln基因的表達，

4、探討VEGF在白血病發(fā)病中的作用及VEGF與survlvln在白血病發(fā)病中的關系。 方法: 應用第一部分成功構建的攜帶靶向VEGF siRNA的重組腺病毒（Ad5-VEGFsi）感染K562細胞。實驗分為三組：實驗組（K562/Ad5-VEGFsi）、空載體組（K562/Ad5）、空白塒照組（K562）。通過RT-PCR方法分別檢測K562細胞內VEGF mRNA及survivin mRNA表達；ELISA方法檢測K56

5、2細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白分泌：Western blot法檢測K562細胞內survivin蛋白表達；MTT法檢測K562細胞增殖及流式細胞儀檢測細胞凋亡。 結果: （1）三組細胞中均有VEGF mRNA表達及其蛋白的分泌；同時，在三組細胞中也檢測到survlvin mRNA及其蛋白的表達。 （2）實驗組VEGF mRNA表達量及其蛋白濃度分別為（0.25±0.06）、（1120.74±14.55）pg/ml

6、，與空載體組及空白對照組相比均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.01）。 （3）實驗組survlvin mRNA及其蛋白表達量分別為（0.42±0.03）、（0.26±0.01），與空載體組及空白對照組相比也明顯降低（p<0.01）。 （4）實驗組細胞凋亡率為（16.45±0.14）％較空載體組及空白對照組明顯增加（p<0.01）；實驗組細胞的生存力下降，增殖受到抑制，與空載體組及空白對照組相比有顯著差異（p<0.01

7、）。 結論: （1）人白血病K562細胞表達VEGF mRNA并分泌VEGF蛋白。 （2）攜帶靶向VEGF siRNA的重組腺病毒Ad5-VEGFsi可明顯抑制K562細胞VEGF mRNA表達及VEGF蛋白分泌。 （3）K562細胞感染Ad5-VEGFsi后，細胞凋亡明顯增加，生存力降低，增殖受到抑制。VEGF在細胞內的過度表達，使腫瘤細胞具有抵抗細胞凋亡及惡性增殖的能力。 （4）隨著VEGF表