Kupffer細胞表達PD-L1在大鼠肝移植免疫耐受誘導中的作用.pdf

1、目的：（1）建立穩(wěn)定的大鼠肝移植動物模型，觀察從Brown Norway（BN）→BN和Lewis（LEW）→BN大鼠肝移植術后移植肝臟的免疫反應、程序性死亡配體1（programmed death ligand1，PD-L1）以及輔助性T細胞1類（T helper cells-1，Th1）和輔助性T細胞2類（T helper cells-2，Th2）細胞因子在移植肝臟中的表達情況。（2）分離術后7天移植肝臟中的枯否細胞（Kupffer

2、 cells，KCs），觀察其表達PD-L1的情況以及對淋巴細胞（lympholeukocytes，LCs）的增殖、凋亡以及功能的影響。（3）利用基因克隆技術，通過設計簡并性引物，以大鼠肝臟cDNA為模板，采用pUC19質粒載體，克隆大鼠PD-L1基因。（4）構建針對大鼠PD-L1基因編碼區(qū)的短發(fā)夾型RNA（short hairpin ribonucleic acid，shRNA）表達質粒PD-L1-shRNA，觀察PD-L1-shRN

3、A對KCs PD-L1基因和蛋白表達的抑制效果及其對LCs功能的影響，試圖闡明PD-L1與KCs在大鼠肝移植免疫耐受誘導中的作用及機制。 方法：（1）采用Kamada“二袖套法”建立BN→BN和LEW→BN肝移植動物模型。術后觀察大鼠存活率和生存質量，并于1、3、5及7天分別活殺6只取外周血及肝臟組織標本。光鏡觀察肝臟組織形態(tài)學改變；全自動生化分析儀檢測外周血漿丙氨酸氨基轉移酶（alanineaminotransferase，A

4、LT）、天冬氨酸轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）和總膽紅素（total bilirubin，TBIL）；ELISA、real-time PCR和免疫組織化學分別檢測Th1類細胞因子白介素2（interleukin-2，IL-2）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和Th2類細胞因子白介素10（interleu

5、kin-10，IL-10）在血漿和移植肝臟中的表達情況，免疫組織化學檢測PD-L1在兩種動物模型移植肝臟中的表達情況。（2）分離術后7天移植肝臟中KCs，real-time PCR和Western-blot分別檢測KCs PD-L1的基因和蛋白的表達情況。將KCs與LCs共同培養(yǎng)24h，3H標記的脫氧核糖核苷（hydrogen3-thymine deoxyriboside，3H-TdR）摻入法和流式細胞計數(shù)分別檢測LCs的增殖和凋亡情況

6、，ELISA檢測培養(yǎng)上清液中IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-10的含量。（3）利用PCR技術，以大鼠肝臟組織cDNA為模板擴增PD-L1基因片段，PCR產(chǎn)物膠回收后與載體pUC19連接，并轉化DH5α感受態(tài)細菌，隨機挑取白色菌落通過PCR和測序鑒定陽性重組載體的正確性。（4）根據(jù)RNA干擾（ribonucleic acid interfere，RNAi）作用原理設計針對大鼠PD-L1的shRNA，利用pRNAT-U6.2質粒，構

7、建重組干擾質粒pPD-L1-A、pPD-L1-B及其陰性對照質粒pPD-L1-C。經(jīng)PCR及測序鑒定重組成功后，用脂質體轉染大鼠KC，轉染24小時以后與活化的T細胞共同培養(yǎng)。Real-time PCR和Western bolt檢測干擾質粒對KCs PD-L1基因和蛋白表達的抑制作用，ELISA檢測上清液中IL-2、INF-γ、TNF-α和IL-10的含量。 結果：（1）采用改良的Kamada“二袖套法”成功建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移

8、植動物模型。發(fā)現(xiàn)BN→BN大鼠肝移植后一直未見明顯的急性排斥反應表現(xiàn)，可長期存活。而LEW→BN大鼠肝移植術后3天開始出現(xiàn)急性排斥反應病理表現(xiàn)（Banff標準），術后第5至7天比較典型，7只受鼠于16天內全部死亡。LEW→BN組大鼠術后血漿ALT、AST和TBIL呈現(xiàn)進行性升高，而BN→BN組則逐漸降至正常范圍，兩組差異明顯（P<0.05）。ELISA結果顯示：BN→BN組術后7天，血漿中IL-2、INF-γ和TNF-α（分別為210.

9、68±16.82、170.97±14.64和126.4±15.57，pg/ml）的濃度明顯低于LEW→BN（分別為753.50±12.68、509.83±17.91和427.97±13.49，pg/ml）組，而IL-10（371.13±17.63，pg/ml）的濃度則明顯高于LEW→BN組（187.48±12.89，pg/ml）（P<0.05）。Real-time PCR和免疫組織化學表明上述細胞因子在兩種動物模型移植肝臟中的表達情況與

10、其血漿中的表達趨勢一致。免疫組織化學結果顯示：術后第7天PD-L1呈強陽性表達并且表達范圍廣；而在LEW→BN組PD-L1表達始終較弱，兩組比較有明顯差異（P<0.05）。 （2）免疫耐受組中KCs PD-L1的表達明顯高于排斥組（P<0.05）。KCs+LCs共培養(yǎng)組LCs的增殖（13258.34±951.26 cpm）明顯低于LCs單獨培養(yǎng)組（3047.98±101.42 cpm，P<0.05），而其凋亡率（8.83±0.3

11、7％）卻顯著高于后者（1.34±0.16％，P<0.05）。共培養(yǎng)組上清液的IL-2、TNF-α和INF-γ的含量（分別為186.50±12.68、142.83±17.91和129.97±13.49，pg/ml）明顯低于LCs單獨培養(yǎng)組（分別為481.76±34.53、357.16±19.88和326.4±15.57，pg/ml），但IL-10在共培養(yǎng)組（108.8±12.89 pg/ml）明顯高于LCs單獨培養(yǎng)組（49.13±17.6

12、3 pg/ml，P<0.05）。 （3）采用PCR方法從大鼠肝臟組織中擴增出約873bp的DNA片段，連接到pUC19載體成功構建重組質粒，其擴增的目的片段經(jīng)PCR和測序驗證為PD-L1基因片段，克隆的PD-L1與GenBank中小鼠PD-L1（NM_008798）序列同源性達到88％，其翻譯蛋白與小鼠PD-L1理論蛋白同源性為85％。 （4）經(jīng)PCR及測序證實重組干擾質粒pPD-L1-A、pPD-L1-B及其陰性對照質

13、粒pPD-L1-C構建成功，并在脂質體介導下可以高效轉染KCs。轉染24小時后，RNA干擾組PD-L1表達水平均明顯低于未轉染組和RNAi對照組。其中pPD-L1-B對KCs PD-L1的表達有較好的抑制效果。pPD-L1-B組上清液中IL-2、IFN-γ和TNF-α的含量（分別為448.70±37.61、327.33±24.35和301.62±17.72，pg/ml）明顯高于未轉染組（分別為179.60±20.47、153.46±10

14、.70和118.90±15.65，pg/ml），而IL-10的表達則正好相反（分別為40.03±7.81和103.2±17.46，P<0.05）。 結論：（1）PD-L1在免疫耐受移植肝臟中的表達明顯高于急性排斥組，PD-L1可能通過調節(jié)LCs的功能，影響Th1和Th2細胞因子的平衡從而參與了移植后免疫反應過程的調控。（2）免疫耐受組移植肝臟中KCs PD-L1的表達水平明顯高于急性排斥組。高表達PD-L1的KCs可以顯著性抑制

15、LCs的增殖、活化及功能，可能在誘導免疫耐受方面具有重要作用。（3）成功克隆了PD-L1基因，首次構建了pUC19-PD-L1克隆質粒?？寺』蚪?jīng)測序證明與小鼠PD-L1具有較好的同源性。（4）利用克隆的PD-L1可以成功構建出PD-L1-shRNA干擾質粒，其在體外可以有效抑制KCs PD-L1的表達，消除KCs對LCs功能的抑制作用，證實KCs通過高表達PD-L1可以有效抑制LCs功能。表明PD-L1與KCs在肝移植免疫耐受的誘導和