慢病毒介導靶向沉默Gankyrin基因表達治療肝細胞癌的實驗研究.pdf

1、肝細胞性肝癌(Hepatocullularcarcinoma,HCC)作為人類最常見、惡性程度最高的惡性腫瘤之一，有著較高的發(fā)病率和死亡率。我國是世界上肝癌發(fā)病集中的國家之一，全球每年新發(fā)生的肝癌患者中有45％在我國大陸地區(qū)，嚴重地威脅著人民的身體健康。手術切除和肝臟移植是目前治療肝癌較為有效的方法，但由于肝癌具有惡性程度高、發(fā)展迅速、容易復發(fā)和轉移等特點，肝癌患者中僅有一部分人適合外科手術治療。絕大部分肝癌患者只能依賴于放療、化療及其

2、它的一些姑息療法。發(fā)展新的肝癌治療手段和治療途徑已成為廣大醫(yī)務工作者迫切需要研究和解決的問題。 實驗目的： 1.制備兔抗Gankyrin多克隆抗體，為后續(xù)實驗中Gankyrin蛋白表達的定性、定量檢測提供實驗工具。 2.構建并制備攜帶靶向沉默Gankyrin基因shRNA的慢病毒載體，為后續(xù)驗證采用該表達系統(tǒng)進行肝癌基因治療有效性的體內和體外實驗提供基本的實驗工具。 3.探討慢病毒介導靶向沉默Gankyr

3、in基因表達系統(tǒng)對肝癌細胞生物學特性的影響，為該系統(tǒng)最終應用于肝癌的臨床治療提供科學的理論和實驗依據(jù)。 實驗方法： 1.兔抗Gankyrin多克隆抗體的制備、純化及鑒定 1.1采用基因克隆技術構建pET30a(+)-Gankyrin表達載體質粒并進行酶切鑒定； 1.2通過IPTG誘導Gankyrin蛋白原核表達獲得His6-Gankyrin融合蛋白； 1.3以純化的His6-Gankyrin融合蛋

4、白作為抗原進行免疫反應制備兔抗Gankyrin多克隆抗體，并進行抗體特異性和反應性檢測。 2.靶向沉默Gankyrin基因shRNA慢病毒載體的構建和制備 2.1根據(jù)Gankyrin基因(NM002814)CDS區(qū)編碼序列設計、選擇三段19nt的寡核苷酸序列作為靶向Gankyrin基因的shRNA片段序列，并以此合成三對長引物單鏈DNA片段，經(jīng)退火、雙酶切后與同樣雙酶切的質粒pDC316-EGFP-U6連接、轉化，獲得三

5、個質粒； 2.2將獲得的質粒分別轉染肝癌細胞株SMMC-7721，以RT-PCR和Westernblot方法篩選對Gankyrin基因表達沉默作用最為明顯的質粒；再以該質粒為基礎通過基因克隆技術構建攜帶有靶向沉默Gankyrin基因shRNA片段的慢病毒包裝質粒plenti6/V5-shRNA(Gankyrin)-EGFP； 2.3采用Invitrogen公司的四質粒共轉染系統(tǒng)，制備Lenti-shRNA(Gankyri

6、n)-EGFP慢病毒表達載體系統(tǒng)，并進行相關質量檢測。 3.重組慢病毒介導靶向沉默Gankyrin基因對肝癌細胞生物學特性的影響 3.1采用構建的Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP慢病毒表達載體系統(tǒng)感染肝癌細胞株SMMC-7721，分別檢測該載體系統(tǒng)在體外對肝癌細胞生長抑制率、凋亡率、GankyrinmRNA和蛋白表達的影響； 3.2建立肝癌細胞SMMC-7721移植瘤模型，成瘤后使用Lenti

7、-shRNA(Gankyrin)-EGFP慢病毒表達載體進行瘤體注射，觀察其對荷瘤裸鼠移植瘤生長、移植瘤GankyrinmRNA的影響，以及移植瘤形態(tài)學的改變。 實驗結果： 1.兔抗Gankyrin多克隆抗體的制備、純化及鑒定 1.1酶切鑒定結果顯示構建的pET30a(+)-Gankyrin表達載體質粒正確，轉化入宿主大腸桿菌后通過IPTG可誘導Gankyrin蛋白； 1.2ELISA和WesternBl

8、ot檢測結果顯示，以純化的His6-Gankyrin融合蛋白作為抗原制備的兔抗Gankyrin多克隆抗體有較好的反應性和特異性，可以滿足后續(xù)實驗的要求。 2.靶向沉默Gankyrin基因shRNA慢病毒載體的構建和制備 2.1鑒定結果顯示3個攜帶靶向沉默Gankyrin基因shRNA片段的質粒構建正確，均攜帶有啟動EGFP轉錄的CMV啟動子和啟動shRNA序列轉錄的U6啟動子。RT-PCR和Westernblot方法篩選

9、結果顯示其中的pDC316-EGFP-U6-shRNA(Cankyrin)1質粒剔降SMMC-7721細胞Gankyrin表達效果最好。以該質粒為基礎構建的慢病毒包裝質粒pLenti6/V5-shRNA(Gankyrin)-EGFP經(jīng)鑒定顯示質粒構建準確。 2.2通過四質粒共轉染策略制備的高滴度慢病毒表達載體系統(tǒng)Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP，經(jīng)PCR鑒定和EGFP的活性觀察等檢測方法，確認該慢病毒構建正確

10、、滴度高、感染活性高。 3.重組慢病毒介導靶向沉默Gankyrin基因對肝癌細胞生物學特性的影響 3.1MTT法檢測體外培養(yǎng)SMMC-7721細胞生長結果顯示空白對照組與慢病毒對照組細胞之間相比，細胞生長率差異無顯著性意義(P>0.05)； 3.2流式細胞儀對體外培養(yǎng)SMMC-7721細胞凋亡率的檢測結果顯示，Lemi-shRNA(Gankyrin)-EGFP感染細胞48h后，肝癌SMMC-7721細胞凋亡率明顯

11、高于空白對照組、慢病毒對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 3.3Lemi-shRNA(Gankyrin)-EGFP載體表達系統(tǒng)對體外培養(yǎng)SMMC-7721細胞GankyrinmRNA水平和Gankyrin蛋白表達影響的檢測結果顯示，空白對照組、慢病毒對照組之間GankyrinmRNA和Gankyrin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)； 3.4全部裸鼠接種肝癌細胞系SMMC-7721單細胞懸液后，均存活

12、并有皮下移植瘤形成。 3.5荷瘤裸鼠使用Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP慢病毒表達載體進行瘤體內注射，3w后處死，結果顯示Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP慢病毒表達載體瘤體內注射可顯著抑制移植瘤的生長，其移植瘤體積和重量均明顯低于對照組移植瘤的體積和重量，差異有顯著性意義(P<0.05)。 3.6荷瘤裸鼠移植瘤GankyrinmRNA水平檢測結果顯示，Lenti-shRNA(Gan

13、kyrin)-EGFP瘤體內注射3w后檢測裸鼠移植瘤組織GankyrinmRNA水平低于對照組，差異有顯著性意義(P<0.05)，Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP慢病毒載體系統(tǒng)可顯著抑制肝細胞癌組織中Gankyrin表達。 3.7荷瘤裸鼠移植瘤HE及免疫組化染色結果顯示，Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP瘤體內注射裸鼠移植瘤可抑制肝細胞癌組織中Gankyrin蛋白表達。 結論：

14、 1.本課題成功構建了pET30a(+)-Gankyrin原核表達載體，將該質粒轉化大腸桿菌后通過IPTG誘導原核表達的方法獲得了His6-tagged-Gankydn融合重組蛋白。 2.以純化的His6-tagged-Gankyrin融合蛋白為抗原制備的兔抗Gankyrin抗血清，經(jīng)Westernblot檢測表明其對His6-tagged-Gankyrin融合重組蛋白和SMMC-7721肝癌細胞中的Gankyrin蛋白具有較

15、好的反應性和特異性。該抗血清可作為免疫反應中的抗體用于檢測Gankyrin蛋白的表達。 3.利用成功構建的慢病毒穿梭質粒載體plemi6/V5-shRNA(Gankyrin)-EGFP，通過四質粒共轉染的策略制備了靶向沉默Gankyrin基因表達的高滴度重組慢病毒載體Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP，經(jīng)PCR鑒定和EGFP的活性觀察等檢測方法，確認該慢病毒載體系統(tǒng)構建正確、滴度高、感染活性高，為下一步開展靶向

16、Gankyfin基因的肝癌基因治療臨床前研究提供了必須的實驗工具。 4.慢病毒載體系統(tǒng)對于肝癌細胞具有較高的轉染效率，是以肝細胞為靶細胞的合適的基因轉移載體。利用慢病毒載體系統(tǒng)實現(xiàn)基因轉移的治療技術可成為進行肝癌基因治療的有效手段。 5.本課題中構建的靶向沉默Gankyrin基因慢病毒載體通過RNAi在體外可有效抑制肝癌細胞系SMMC-7721增殖，剔降肝癌SMMC-772l細胞系GankyrinmRNA和Gankyri

17、n蛋白的表達。 6.體內注射靶向沉默Gankyrin基因慢病毒載體Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP可顯著抑制裸鼠肝癌SMMC-7721細胞皮下移植瘤的生長速度和移植瘤組織GankyrinmRNA及蛋白表達水平，該表達系統(tǒng)可能是肝癌治療的一種有效工具。 本課題的創(chuàng)新性在于： 1.從基因治療的角度探討了慢病毒介導靶向沉默Gankyrin基因表達系統(tǒng)對肝細胞癌的影響及治療意義，為以Gankyrin基