凋亡在丙烯酰胺亞慢性染毒誘導(dǎo)的中毒性神經(jīng)病中的初步研究.pdf

1、目的；為闡明凋亡在丙烯酰胺引起的中毒性神經(jīng)病中的作用，我們建立了大鼠丙烯酰胺亞慢性中毒模型，通過(guò)測(cè)定大鼠染毒后中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織中bcl-2、bax和caspase-3表達(dá)的變化以及核DNA的改變，探討凋亡相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制在丙烯酰胺毒性機(jī)制中的作用，為研究丙烯酰胺誘導(dǎo)的中毒性神經(jīng)病的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。 方法； 1.建立動(dòng)物模型選用雄性成年Wistar大鼠分別以20mg/kg體重和40mg/kg體重劑量腹腔注射染毒，

2、每周3次，連續(xù)2個(gè)月。 2.神經(jīng)行為指標(biāo)測(cè)定密切觀察各組大鼠一般狀況的變化，每周測(cè)量大鼠體重、熱覺(jué)傳導(dǎo)、壓痛閾值、后肢撐力、轉(zhuǎn)棒等指標(biāo)。 3.神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)檢測(cè) 1)形態(tài)學(xué)檢測(cè)通過(guò)對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)、小腦和脊髓石蠟切片的HE染色，觀察是否存在細(xì)胞凋亡或/和壞死的形態(tài)學(xué)變化。 2)TUNEL法檢測(cè)通過(guò)對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)、小腦和脊髓石蠟切片的TUNEL檢測(cè)，確定是否存在核DNA的裂解和細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。

3、 3)凋亡相關(guān)蛋白和酶的檢測(cè)通過(guò)免疫組織化學(xué)方法測(cè)定大腦皮質(zhì)、小腦和脊髓石蠟切片中Bcl-2和Bax免疫活性的變化；通過(guò)Westernblotting測(cè)定大腦皮質(zhì)、小腦、脊髓和坐骨神經(jīng)中bcl-2、bax和caspase-3表達(dá)的變化。 4)DNALadder的檢測(cè)測(cè)定大腦皮質(zhì)、小腦和脊髓提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳是否存在DNALadder，來(lái)確定是否存在特征性的180～200bp的DNA裂解片段。 結(jié)果 1

4、.體重與神經(jīng)功能測(cè)試結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，中毒后大鼠體重減輕。神經(jīng)行為學(xué)測(cè)定結(jié)果表明，大鼠熱覺(jué)傳導(dǎo)異常(高劑量組時(shí)間延長(zhǎng)55％，低劑量組縮短39％)，壓痛閾值變小(第3周高劑量組降低45％，第7周低劑量組降低45％)，后肢展開(kāi)距離明顯加寬(高劑量組增加109％，低劑量組增加59％)，在轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間縮短(高劑量組縮短98％，低劑量組縮短81％)，都有顯著性差異(P＜0.05)。 2.HE染色結(jié)果顯示： 1)大腦皮質(zhì)：

5、丙烯酰胺染毒組的組織切片并不見(jiàn)細(xì)胞數(shù)目的減少和細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)改變，也無(wú)明顯的凋亡，但低劑量組可見(jiàn)核染色質(zhì)致密濃縮，高劑量組濃縮核進(jìn)一步增多。 2)小腦：與對(duì)照組相比，染毒組小腦切片上浦肯野細(xì)胞明顯減少。 3)脊髓腰膨大：正常對(duì)照組和染毒組并沒(méi)有明顯差異。 3.免疫組化結(jié)果顯示： 1)大腦皮質(zhì)：Bcl-2和Bax的陽(yáng)性反應(yīng)物定位在細(xì)胞漿，均勻分布，胞核不著色。圖像分析結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，陽(yáng)性細(xì)胞B

6、cl-2免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度低劑量組降低了14％，高劑量組升高了20％，有顯著性差異(P＜0.05)；染毒組Bax免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異。 2)小腦皮質(zhì)：Bcl-2和Bax蛋白在浦肯野細(xì)胞和分子層神經(jīng)細(xì)胞中的染色強(qiáng)度明顯大于顆粒層細(xì)胞。圖像分析結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，陽(yáng)性細(xì)胞Bcl-2免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度低劑量組降低了22％，高劑量組升高了62％，均有顯著性差異(P＜0.01)；Bax免疫反應(yīng)

7、產(chǎn)物的積分光度與對(duì)照組相比，低劑量升高了22％(P＜0.05)，高劑量組降低了30％(P＜0.01)。 3)脊髓腰膨大：圖像分析結(jié)果表明：與正常對(duì)照組相比，陽(yáng)性細(xì)胞Bcl-2免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度在低劑量組降低了20％，高劑量組升高了12％，均有顯著性差異(P＜0.05)；Bax免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度與對(duì)照組相比，兩組均無(wú)顯著性差異。 4.Westernblotting分析結(jié)果顯示： 1)大腦皮質(zhì)：光密度分析

8、結(jié)果表明，bcl-2的表達(dá)在低劑量組降低了22％，高劑量組升高了26％，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)；bax和caspase-3在低、高劑量組的表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。 2)小腦：與對(duì)照組相比，bcl-2的表達(dá)在低劑量組降低了25％，高劑量組升高了13％，均有顯著性差異(P＜0.05)；bax的表達(dá)在低劑量組升高了14％，高劑量組降低了17％，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)；染毒組caspase-3

9、的表達(dá)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異。 3)脊髓：bcl-2的表達(dá)與對(duì)照組相比均有顯著性差異，低劑量組降低了33％(P＜0.01)，高劑量組升高了25％(P＜0.05)；染毒后bax的表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異；caspase-3在低劑量組的表達(dá)增加了41％，高劑量組增加了132％，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.01)。 4)坐骨神經(jīng)：與對(duì)照組相比，bcl-2的表達(dá)在低劑量組增加了104％，高劑量組增加了196％，均

10、有顯著性差異(P＜0.01)；bax的表達(dá)在低劑量組增加了49％，高劑量組增加了94％，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)；caspase-3的表達(dá)低劑量組增加了8％，高劑量組升高了66％，高劑量組與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。 5.TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示：光鏡下可見(jiàn)，DNaseⅠ降解處理后陽(yáng)性對(duì)照的大腦皮質(zhì)、小腦皮質(zhì)和脊髓中的細(xì)胞核呈圓形和不規(guī)則形，棕染，著色深，細(xì)胞界限不清。實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組切片上細(xì)胞核均

11、無(wú)著色，表明丙烯酰胺染毒后神經(jīng)元幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，沒(méi)有3'-OH形成。 6.DNA瓊脂糖電泳結(jié)果顯示：大腦皮質(zhì)、小腦的對(duì)照組和脊髓的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組只出現(xiàn)一條距加樣孔很近的大分子條帶；小腦低劑量染毒組核DNA電泳后可觀察到不典型的DNALadder，高劑量組則可見(jiàn)涂片狀的DNA電泳結(jié)果，并可見(jiàn)不明顯的梯狀；染毒組大腦皮質(zhì)核DNA電泳呈彌散的片狀圖譜，表明丙烯酰胺可引起大腦皮質(zhì)和小腦神經(jīng)細(xì)胞DNA的損傷。 結(jié)論 1.

12、丙烯酰胺亞慢性染毒可引起： 1)大鼠的熱覺(jué)傳導(dǎo)異常，痛覺(jué)傳導(dǎo)加快，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力降低。 2)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞核發(fā)生致密濃縮性改變，小腦浦肯野細(xì)胞丟失。 3)大腦皮質(zhì)、小腦和脊髓Bcl-2/Bax改變，低劑量組降低，高劑量組升高。 4)脊髓和坐骨神經(jīng)中caspase-3表達(dá)增加。 5)坐骨神經(jīng)中bcl-2和bax的表達(dá)增加。 6)中樞神經(jīng)細(xì)胞不存在凋亡引起的DNA裂解。