胃腸道間質(zhì)瘤PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的檢測及其意義.pdf

1、胃腸道間質(zhì)瘤(Gastrointestinal stromal tumor，GIST)是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，占胃腸道腫瘤的1％—4％，每年發(fā)病率約2/10萬。本病無明顯性別、種族差異，可發(fā)生于消化道的任何部位，最常見的原發(fā)部位是胃和小腸，其次是結(jié)直腸和食管，還可以發(fā)生于網(wǎng)膜、系膜和后腹膜等胃腸道外部位。過去對GIST的組織發(fā)生、生物學(xué)行為、腫瘤的惡性程度都不十分明確，這就給臨床診治帶來了很多混淆。近幾年隨著免疫組織化學(xué)、分子生物

2、學(xué)、基因診斷和治療的發(fā)展，以及甲磺酸伊馬替尼(Glivec)的出現(xiàn)，GIST診斷與治療取得了很大的進(jìn)展。盡管如此，與其它腫瘤相比，GIST腫瘤性質(zhì)不可預(yù)測性仍較為突出，其生物學(xué)特征仍較難以評估，如何控制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移仍是目前治療所面臨的主要問題。 腫瘤的發(fā)生涉及到多種細(xì)胞事件及生理過程，其中細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的異常是細(xì)胞癌變的主要原因之一。磷脂酰肌醇3—激酶(PI3K)信號參與增值、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。近

3、年來發(fā)現(xiàn)，IA型PI3K和其下游分子蛋白激酶B(PKB或Akt)所組成的信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用，并且已經(jīng)成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。進(jìn)一步探討該通路的調(diào)節(jié)以及與其他通路的交聯(lián)，提高對該通路在人類各種常見腫瘤中的作用的認(rèn)識，有助于更好地理解腫瘤細(xì)胞的惡性行為。該通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，其活性異常不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而且與腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等相關(guān)。 腫瘤血管生成是

4、腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要條件，PI3K/Ak信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了多種因子所介導(dǎo)的腫瘤血管生成過程。HIF—1作為腫瘤微環(huán)境中的一個(gè)至關(guān)重要的調(diào)節(jié)因子，在促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤的侵襲性方面起中心作用。HIF—1發(fā)揮作用主要是由HIF—1α亞基的表達(dá)和活性決定的。PI3K/Akt信號途徑可以通過抑癌基因PTEN的調(diào)控來調(diào)節(jié)HIF—1α蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)缺氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞對缺氧的一系列適應(yīng)性反應(yīng)。參與腫瘤細(xì)胞的代謝、血管擴(kuò)張、新血管形成等

5、。 近年來，關(guān)于PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的報(bào)道日益增多，但是對于研究有關(guān)PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在GIST中系統(tǒng)的表達(dá)變化的報(bào)道仍然很少。本實(shí)驗(yàn)中我們通過對GIST組織PI3K/Akt信號通路中PI3K、Akt和PTEN的mRNA水平以及蛋白表達(dá)變化的檢測，同時(shí)進(jìn)一步討論探討P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活后，其下游的細(xì)胞凋亡相關(guān)因子、促血管生成因子以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)變化，探討其表達(dá)與GIST臨床病理特征及預(yù)后的

6、相關(guān)性，并探討它們間的相互關(guān)系，以此揭示其在GIST發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為進(jìn)一步的腫瘤靶點(diǎn)治療提供理論依據(jù)。 材料與方法： 1、研究對象 選擇臨床病理資料完整、隨訪結(jié)果確切的中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1990年～2007年2月手術(shù)切除、病理證實(shí)的GIST新鮮組織標(biāo)本124例。男性64例、女性60例，年齡9～79歲、平均54.6歲。腫瘤發(fā)生于胃62例(50.0％)、小腸28例(22.6％)、結(jié)直腸14例(11.3％

7、)、食管9例(7.3％)、胃腸道外11例(8.9％)(其中網(wǎng)膜4例、腸系膜4例、后腹膜3例)。GIST蠟塊組織標(biāo)本124例。男性64例、女性60例，年齡9～79歲、平均54.6歲。腫瘤發(fā)生于胃62例(50.0％)、小腸28例(22.6％)、結(jié)直腸14例(11.3％)、食管9例(7.3％)、胃腸道外11例(8.9％)(其中網(wǎng)膜4例、腸系膜4例、后腹膜3例)。 2、相關(guān)分子生物學(xué)試劑 PTEN(10P01)： sc—734

8、20；p—Akt1/2/3(Thr308)—R： sc—16646—R；p-PI3—kinase p85α(Tyr508)： sc—12929： HIF—1α(3C144)： sc—71247；NOS2(C—11)： sc—7271；VEGF(C—1)：sc—7269；uPA(H—140)： sc—14019；MMP—2(884)： sc—13595；MMP—9(M—17)：sc—6841；TGF-β1(500-M66)： sc—653

9、78(Santa Cruz)；HRP標(biāo)志的第二抗體(北京中杉公司)；硝酸纖維素膜(Takara公司)；RT-PCR試劑盒(Takara公司)；DAB顯色底物(Takara公司)；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Takara公司)；PCR引物(Takara公司)；其他試劑為國產(chǎn)分析純。 3、RT-PCR檢測相關(guān)因子在GIST及對照組的mRNA水平 mRNA提取按QuickPrep micro mRNA Purification試劑盒說

10、明書進(jìn)行：主要包括：樣品的準(zhǔn)備，mRNA的分離，分別用高鹽緩沖液和低鹽緩沖液對已結(jié)合mRNA的oligo(dT)纖維顆粒的洗滌，mRNA的洗脫。用TaKaRa RNA PCR(AMV) V3.0試劑盒，按操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后成像。 4、Western印跡法檢測相關(guān)因子在GIST及對照組的表達(dá) 0.5g GIST加入1ml細(xì)胞裂解緩沖液(Cell signaling Technology，

11、Beverly，MA)及1mmol的PMSF(苯甲基磺酰氟)勻漿。按常規(guī)步驟提取蛋白，測定蛋白濃度。電泳前，加入SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5 min，離心后上樣，12％ SDS-PAG分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，一抗孵育，堿性磷酸酶偶聯(lián)的IgG作為二抗，O—dianidine及β—naphthyl acid phosphate作為堿性磷酸酶底物顯色。 5、免疫組織化學(xué)檢測HIF—1α、NOS2、VEGF在GIST及對

12、照組的表達(dá) 取GIST組織經(jīng)中性福爾馬林固定、石蠟包埋后切成4μm薄片至玻片。玻片常規(guī)脫蠟，滴加1滴或50ul封閉血清，傾去血清，每張切片滴加1滴或50ul一抗，孵育后洗脫，然后每張切片滴加1滴或50ul EnvisionTM二抗孵育，用新鮮配制的Envision TM顯色底物DAB液顯色，1～2分鐘。 結(jié)論： 1、在GIST中，隨其NIH分級PI3K、Akt表達(dá)上調(diào)，而抑癌基因PTEN的表達(dá)下調(diào)。三者陽性表達(dá)率

13、與性別、年齡、組織學(xué)類型無關(guān)，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和黏膜受侵關(guān)系密切。PI3K/Akt與PTEN在GIST的發(fā)生發(fā)展中可能互相拮抗共同作用，PI3K、Akt蛋白陽性表達(dá)之間呈顯著正相關(guān)(r=0.292，P=0.031)；P13K與PTEN蛋白陽性表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.412，P=0.036)；PTEN與Akt蛋白陽性表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.386，P=0.024)。PI3K高表達(dá)或Akt高表達(dá)患者無瘤生存期顯著縮短，兩者均高

14、表達(dá)，預(yù)后更差；PTEN低表達(dá)患者無瘤生存期短，PTEN低表達(dá)且Akt高表達(dá)，PTEN低表達(dá)且PI3K高表達(dá)無瘤生存期顯著縮短。 2、GIST中PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化可以進(jìn)一步激活NF—κB mRNA，從而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控凋亡相關(guān)因子XIAP、bcl—2以及survivin mRNA水平的表達(dá)。NF—κB、XIAP、bcl—2以及survivin mRNA的表達(dá)變化與NIH分級，以及腫瘤的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、黏膜受侵密切相

15、關(guān)，而與年齡、性別、組織學(xué)類型無關(guān)。由于NF—κB的調(diào)控作用，各指標(biāo)之間mRNA的水平變化呈正相關(guān)。 3、在血運(yùn)豐富的GIST中，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可以活化HIF—1α，HIF—1α、NOS2和VEGF以及MVD的表達(dá)與GIST的NIH分級、腫瘤黏膜受侵及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，與其他臨床病理特征沒有有明顯的相關(guān)性。我們的研究提示，HIF—1α、NOS2和VEGF的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(rl=0.368，r2=0.45

16、2，r3=0.392，P1，P2，P3<0.05)。由此認(rèn)為，三者可能在GIST侵襲、轉(zhuǎn)移及血管新生中有相互依賴的正調(diào)控作用，三者共同參與了GIST的發(fā)生發(fā)展。因此，我們認(rèn)為HIF—1α、NOS2和VEGF表達(dá)可能是惡性腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。 4、我們發(fā)現(xiàn)在GIST中TGF-β1可以介導(dǎo)PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)uPA，進(jìn)而激活MMP—2及MMP—9，有效地降解細(xì)胞外基質(zhì)。隨著腫瘤浸潤深度的加深，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移程度