組蛋白乙?；揎棇π∈蠛艘浦才呋蚪M重編程的調控.pdf

1、眾所周知，分化的體細胞核重編程為全能性狀態(tài)的效率非常低。盡管，已有大量試驗證實核移植重構胚能夠發(fā)育到囊胚期，但到足月階段的比例卻非常有限。對核重編程機制的進一步理解，將有助于提高核移植效率。本研究以小鼠乳腺癌細胞為供體進行核移植，采用實時定量RT-PCR技術，探索了體細胞核移植胚胎早期發(fā)育的基因表達模式；在此基礎上，對組蛋白乙酰化在體細胞克隆胚核重編程中的作用進行深入研究。 1、小鼠乳腺癌細胞為供體的核移植重構胚的發(fā)育本試驗以小

2、鼠乳腺癌細胞為供體利用Piezo輔助進行核移植，成功構建了體細胞克隆胚胎。結果顯示，經(jīng)電擊融合，融合率達到76.3％(116/152)；化學激活(Sr<'2+>)后，90.5％(105/116)的重構胚形成原核。體外繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，77.1％(81/105)的重構胚發(fā)育到2-細胞；4-細胞和桑椹胚的發(fā)育率分別達到45.7％(48/105)和17.1％(18/105)。 2、發(fā)育相關基因在小鼠核移植胚基因組重編程中的表達研究為

3、了分析乳腺癌細胞核移植重構胚的重編程能力，首先必須建立乳腺癌細胞的基因表達模式。采用實時定量RT-PCR技術，檢測了ErbB2、Mucl、eIF-4C、MuERV-L和c-mos基因在小鼠乳腺癌細胞中的表達情況。為了便于與核移植胚中上述基因表達的比較，選取50個乳腺癌細胞(與核移植胚數(shù)目相同)分析上述基因的表達狀態(tài)。結果發(fā)現(xiàn)ErbB2和Mucl基因在乳腺癌細胞中高表達，但未檢測到eIF-4C、MuERV-L和c-mOS基因的轉錄。運用同

4、樣的方法檢測了乳腺癌細胞核移植胚中上述基因的表達模式。結果發(fā)現(xiàn)，eIF-4C和MuERV-L基因在克隆胚的1-細胞和2-細胞階段均有表達，且與IVF胚胎呈現(xiàn)相同的表達趨勢，即1-細胞階段低表達，2-細胞期瞬時高表達。然而在克隆胚中的表達水平顯著下降(P<0.05)；值得一提的是，在IVF胚胎2-細胞階段無表達產(chǎn)物的c-mos基因，在克隆胚的2-細胞中被檢測到，推測可能是核移植胚中c-mos基因母源轉錄物未能得到有效降解亦或是核的重編程過

5、程導致c-mos重新轉錄。此外，在克隆胚和IVF胚中均未檢測到ErbB2和Mucl基因的表達。本實驗證明核移植后的核質相互作用抑制了分化細胞特有的基因表達，并建立了新的基因表達模式。 3、組蛋白乙?；谛∈蠛艘浦才呋蚪M重編程中的作用將小鼠乳腺癌細胞核移入去核的卵母細胞，構建重組胚，在融合處理后立即加入TSA抑制卵細胞質對供體核的去乙酰化，6h后洗去TsA，再用Sr<'2+>激活并培養(yǎng)到2．細胞階段。結果表明，激活前經(jīng)TSA處理

6、，eIF-4C、MuERV-L和c-mos基因在1-細胞和2-細胞胚胎中的表達水平均有所升高，但與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。采用aphidicolin抑制DNA復制，eIF-4C、MuERV-L和c-mos基因的表達水平也沒有顯著增加。此外，TSA處理的克隆胚在各個階段均未檢測到ErbB2和Mucl基因的表達。以上結果表明，抑制卵細胞質對供體核的去乙?；茨苡绊懙缴鲜龌虻谋磉_模式。提示體細胞核中對胚胎發(fā)育重要基因的重編程

7、是獨立于卵子激活前的組蛋白乙?；录?將TSA處理的時間從激活前處理6 h延長至激活后的6 h(原核已形成)，結果發(fā)現(xiàn)，延長處理后，eIF-4C、MuERV-L和c-mos基因的表達量均顯著增加(P<0.05)；TsA和aphidicolin雙重處理組的基因表達水平與TSA單獨處理組差異不顯著(P>0.05)。在aphicicolin單獨處理組中基因的表達水平也沒有顯著升高，提示基因表達量的顯著增加是由于TSA誘導了核重編程過

8、程中組蛋白高度乙酰化而引起的。此外，在TSA處理延長至激活后6h，也沒有檢測到ErbB2和Mucl基因的轉錄。這表明組蛋白的乙酰化修飾可能沒有參與卵細胞質對分化細胞特有的基因轉錄的抑制，但引起了基因表達模式的變化。 試驗還進一步研究了組蛋白乙?；揎椀淖兓瘜υ缙贗VF和核移植胚發(fā)育的影響。結果顯示，IvF胚胎經(jīng)TSA連續(xù)處理后，基因表達水平顯著提高，2-細胞胚發(fā)育到4-細胞階段的能力受到明顯抑制。然而，核移植胚激活前和激活后連續(xù)

9、TSA處理，核移植胚的2-細胞和4-細胞發(fā)育率分別為90.2％(110/122)和68.9％(84/122)，與未經(jīng)處理的核移植胚對照組相比，發(fā)育率均顯著提高(P<0.05)，尤其4-細胞的發(fā)育率增加了52.4％。核移植胚TSA誘導組蛋白高度乙?；髮е?-細胞階段的基因表達水平顯著升高，且接近于IVF胚胎的基因表達水平。這可能是導致核移植胚發(fā)育率升高的一個主要原因。然而，組蛋白高度乙?；T導的IVF 2-細胞胚基因轉錄和轉錄物的增加，