血栓通注射液不良反應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)的篩查.pdf

1、血栓通注射液是近年來(lái)廣泛用于心血管疾病，以中藥三七中提取出來(lái)的有效活性成分制成的注射劑。其主要成分為三七總皂苷，具有擴(kuò)張血管、改善血液循環(huán)、增加腦血流量、降低外周血管阻力、擴(kuò)張冠脈、顯著降低心臟后負(fù)荷從而降低心肌耗氧量、對(duì)機(jī)體內(nèi)瘀血有直接溶解作用、疏通被阻塞血管、改善血管滲透性等作用。臨床上對(duì)心腦血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等疾病有良好的療效。隨著血栓通注射液在臨床應(yīng)用的增多，關(guān)于其不良反應(yīng)報(bào)道逐漸增加，血栓通注射液安全性備受關(guān)注。血

2、栓通注射液在臨床上常見(jiàn)的不良反應(yīng)主要為過(guò)敏反應(yīng)，包括最為多見(jiàn)的皮疹，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重過(guò)敏性休克、剝脫性皮炎型藥疹、大皰性表皮松懈型藥疹;其它不良反應(yīng)包括局部紅腫疼痛、皮下出血、發(fā)熱、關(guān)節(jié)、肌肉疼痛和低血鉀等。
　　 與青霉素等化學(xué)藥物的過(guò)敏反應(yīng)不同，中藥注射劑在使用過(guò)程中出現(xiàn)大部分藥物過(guò)敏反應(yīng)不是真正意義上的藥物過(guò)敏，而是類過(guò)敏反應(yīng)，嚴(yán)重威脅使用者的生命安全。中藥注射劑出現(xiàn)類過(guò)敏的原因有很多，現(xiàn)代研究也只是對(duì)注射劑整體進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)

3、研究，并沒(méi)有深入揭示其引起不良反應(yīng)的具體成分。迄今為止，藥典推薦的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒荒軠?zhǔn)確預(yù)測(cè)中藥注射劑的致敏潛能。故臨床上中藥注射劑類過(guò)敏反應(yīng)的出現(xiàn)屢見(jiàn)不鮮。研究報(bào)道稱采用建立肥大細(xì)胞體外脫顆粒模型，用于中藥注射劑類過(guò)敏篩查具有一定的意義。目前細(xì)胞體外脫顆粒篩選模型多應(yīng)用各種細(xì)胞系建立模型，其檢測(cè)方法敏感、操作簡(jiǎn)便，其結(jié)果與臨床報(bào)道有一定的相關(guān)性，提示其在評(píng)價(jià)中藥注射劑所致的類過(guò)敏反應(yīng)方面有潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　 血栓通注射液的

4、主要有效成分為三七總皂苷，其具有刺激性，可能是主要引起過(guò)敏以及溶血發(fā)生等不良反應(yīng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。至目前為止，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道血栓通注射液的藥物不良反應(yīng)研究只是停留在注射劑整體水平，并沒(méi)有對(duì)血栓通注射液出現(xiàn)臨床藥物不良反應(yīng)的具體成分進(jìn)行研究。本課題基于血栓通注射液在心血管疾病上良好的治療效果以及其在臨床中出現(xiàn)的藥物不良反應(yīng)上，對(duì)血栓通注射液進(jìn)行有效部位以及成分的分離，同時(shí)應(yīng)用細(xì)胞體外脫顆粒模型和體外溶血實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)敏以及溶血物質(zhì)篩查，試

5、圖探尋其引起臨床過(guò)敏反應(yīng)的具體部位以及成分。
　　 研究目的:
　　 1、血栓通注射液有效部位及成分的分離;
　　 2、完善P815體外脫顆粒模型;
　　 3、血栓通注射液分離部位以及成分的過(guò)敏篩查;
　　 4、血栓通注射液分離部位以及成分的溶血篩查。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、血栓通注射液有效部位以及成分的分離。以血栓通注射液中主要有效成分三七總皂苷為分離對(duì)象，以不同濃度的乙腈

6、-水溶液為流動(dòng)相在制備液相上進(jìn)行制備分離，制備溶液濃縮干燥后于-4℃下保存。通過(guò)高效液相法對(duì)其分離部位以及成分進(jìn)行定性分析。
　　 2、建立LC-MS/MS法測(cè)定中藥注射劑對(duì)P815細(xì)胞脫顆粒后上清液中組胺含量。采用C18柱(4.6 mm×100 mm，3.5μm)進(jìn)行分離，以體積比為60∶40的乙腈～0.5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.3％甲酸）為流動(dòng)相，流速0.4 ml/min;在電噴霧正離子化模式下，采用多離子反應(yīng)檢測(cè)方

7、式(MRM)進(jìn)行檢測(cè);檢測(cè)離子對(duì)為m/z112＞95、112＞68。幾種中藥注射劑對(duì)P815細(xì)胞脫顆粒作用后，取細(xì)胞上清液，經(jīng)過(guò)SPE C18固相萃取柱純化，樣品液分別使用LC-MS/MS法和ELISA法測(cè)定組胺含量，并比較兩者結(jié)果差異;
　　 3、P815細(xì)胞體外脫顆粒模型的研究。首先比較市場(chǎng)上常用的幾種中藥注射劑對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929、小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7、小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞P815三種細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒性情況

8、，以細(xì)胞增殖率(RGR)和細(xì)胞毒性等級(jí)評(píng)價(jià)為指標(biāo)綜合判斷。然后進(jìn)行幾種中藥注射劑對(duì)P815細(xì)胞的體外脫顆粒作用實(shí)驗(yàn)，以LC-MS/MS法和ELISA測(cè)定法分別測(cè)定細(xì)胞脫顆粒后上清液中組胺含量，以底物顯色法測(cè)定細(xì)胞上清液中β-氨基己糖酶的含量，中性紅染色法測(cè)定脫顆粒細(xì)胞率，綜合三個(gè)指標(biāo)判斷幾種中藥注射劑對(duì)P815細(xì)胞的脫顆粒效果。
　　 4、血栓通注射液分離部位以及成分的過(guò)敏篩查。利用P815細(xì)胞體外脫顆粒模型對(duì)血栓通注射液分離部

9、位以及成分進(jìn)行過(guò)敏篩查實(shí)驗(yàn)。先測(cè)定各分離部位以及成分的IC50值，并以其為刺激濃度，通過(guò)ELISA法測(cè)定組胺釋放量，顯色法測(cè)定β-氨基己糖酶釋放量，中性紅法測(cè)定細(xì)胞脫顆粒率。通過(guò)三個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)綜合判斷分離部位以及成分對(duì)P815細(xì)胞的脫顆粒效果。
　　 5、血栓通注射液分離部位以及成分的體外溶血實(shí)驗(yàn)。以不同濃度的分離部位與兔血紅細(xì)胞作用，離心后取上清液，應(yīng)用分光光度計(jì)于575nm下測(cè)定各樣品的吸光度，計(jì)算血栓通注射液各部位的溶血率。

10、
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、血栓通注射液三七總皂苷的部位分離以及成分分離:通過(guò)兩步制備分離得到:6個(gè)部位以及5個(gè)單體，單體分別為人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、和單體1（未知）。
　　 2、建立LC-MS/MS法測(cè)定中藥注射劑對(duì)P815細(xì)胞脫顆粒后上清液中組胺含量:在優(yōu)化條件下，樣品可在6min內(nèi)完成分析，細(xì)胞液中組胺在4.0～128.0μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2=0.9979

11、)。定量限(S/N＞10)為1.2μg/L，檢出限(S/N=3)為0.3μg/L。在標(biāo)準(zhǔn)品濃度為16、64、128μg/L時(shí)，細(xì)胞上清液中組胺的平均回收率為90.46％～94.26％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為4.1％～5.9％。同時(shí)ELISA法和LC-MS/MS法兩種方法測(cè)定組胺含量的結(jié)果比較，ELISA法的測(cè)定結(jié)果在數(shù)量值上總體略高于LC-MS/MS法測(cè)定結(jié)果;同時(shí)，除了野木瓜、天麻素和復(fù)方當(dāng)歸注射液組在統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異外，兩種檢測(cè)方法測(cè)

12、定其他中藥注射劑組的組胺釋放結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)均無(wú)差異(P＞0.05)。
　　 3、幾組中藥注射劑對(duì)P815細(xì)胞的RGR與L929細(xì)胞與RAW264.7細(xì)胞的RGR相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性的差異(P＜0.01);而L929細(xì)胞與RAW264.7細(xì)胞的RGR相比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)沒(méi)有差異(P＞0.05)。參麥、燈盞花素、野木瓜、復(fù)方當(dāng)歸及天麻素五種注射液對(duì)L929和Raw264.7兩種細(xì)胞系的細(xì)胞毒性等級(jí)均在1級(jí)，表示對(duì)其沒(méi)有毒性;同時(shí)對(duì)P815細(xì)胞

13、系的毒性等級(jí)在2～3級(jí)，表示對(duì)其有一定毒性。天花粉蛋白、鹽酸川芎嗪兩種注射液對(duì)對(duì)L929和Raw264.7兩種細(xì)胞系的細(xì)胞毒性等級(jí)均在2級(jí)，表示對(duì)其有一定毒性;同時(shí)對(duì)P815細(xì)胞系的毒性等級(jí)在2～3級(jí)，表示對(duì)其有一定毒性。
　　 在被檢測(cè)的9種注射液中，天花粉蛋白、天麻素和紅茴香三種注射液在三項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)中與陰性對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.01)，提示上述3個(gè)注射劑品種對(duì)P815細(xì)胞有較強(qiáng)的脫顆粒作用;鹽酸川芎嗪、燈盞花素

14、和野木瓜三種注射液在兩項(xiàng)指標(biāo)上均與陰性對(duì)照組相比均顯著性差異(P＜0.01);另一指標(biāo)與陰性組比較有差異(0.01＜P＜0.05)，提示上述注射液對(duì)P815細(xì)胞可能有一定的脫顆粒作用;復(fù)方當(dāng)歸注射液在組胺指標(biāo)上均與陰性對(duì)照組相比有差異(0.01＜P＜0.05);β-氨基己糖酶釋放率指標(biāo)與陰性組比較有顯著性差異(P＜0.01)，提示上述注射液對(duì)P815細(xì)胞可能有一定的脫顆粒作用;相對(duì)而言參麥、參芪扶正兩種注射液在三項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)與陰性對(duì)照組相

15、比差異不明顯(P＞0.05)，提示上述注射液對(duì)P815細(xì)胞的脫顆粒作用相對(duì)較弱。
　　 4、血栓通注射液的分離部位以及成分對(duì)P815的脫顆粒作用:部位2和3、單體人參皂苷Rb1、總皂苷組和陽(yáng)性組在組胺釋放量、β-氨基己糖酶釋放率和細(xì)胞脫顆粒率三項(xiàng)指標(biāo)上與陰性組比較均有顯著性差異(P＜0.01);說(shuō)明它們很可能存在一定的促進(jìn)細(xì)胞脫顆粒的物質(zhì)。部位4在組胺釋放量和β-氨基己糖酶釋放率兩項(xiàng)指標(biāo)上與陰性組比較有顯著性差異(P＜0.01)

16、;說(shuō)明可能兩者存在一定促進(jìn)細(xì)胞脫顆粒的物質(zhì)。人參皂苷Rg1組胺釋放量陰性組比較有差異(0.01＜P＜0.05);β-氨基己糖酶釋放率指標(biāo)上與陰性組比較有顯著性差異(P＜0.01);說(shuō)明可能兩者存在一定促進(jìn)細(xì)胞脫顆粒的物質(zhì)。部位1、6和單體1（未知）以及人參皂苷Rd在三個(gè)指標(biāo)上與陰性組比較都沒(méi)有差異(P＞0.05)，提示上述物質(zhì)的細(xì)胞脫顆粒作用較弱。
　　 5、血栓通注射液的分離部位以及成分體外溶血性實(shí)驗(yàn):三七總皂苷、部位1、2和

17、5的溶血性不明顯，只有在高濃度（＞4 mg/ml）下才表現(xiàn)出輕微的溶血性，而較低濃度(＜4 mg/ml)下基本沒(méi)有溶血性。而總皂苷分離部位2、3、4、6在大于1mg/ml濃度下表觀一定的溶血性，在小于1mg/ml溶血性表觀不明顯。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　 1、LC-MS/MS法測(cè)定中藥注射劑對(duì)P815細(xì)胞脫顆粒后上清液中組胺含量，具有穩(wěn)定、快速、靈敏，同時(shí)與經(jīng)典ELISA測(cè)定組胺方法相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可用于含量極低的生物

18、樣品和大批量樣品的檢測(cè)，為后面中藥注射劑對(duì)P815細(xì)胞脫顆粒作用后細(xì)胞上清液中的組胺含量測(cè)定提供可靠的方法。
　　 2、P815細(xì)胞與非肥大細(xì)胞相比，對(duì)于中藥注射劑引起的細(xì)胞毒性更敏感，對(duì)于中藥注射液類過(guò)敏反應(yīng)的檢測(cè)與臨床結(jié)果有較好的相關(guān)性，提示P815細(xì)胞脫顆粒模型用于中藥注射劑類過(guò)敏物質(zhì)的篩查具有一定的可行性。
　　 3、三七總皂苷和部位2、3、4也很有可能存在一定的促進(jìn)細(xì)胞脫顆粒的物質(zhì)，可能與其極性較小、難溶于水，

19、在三七總皂苷中所占比例較大等有關(guān)，同時(shí)其均含有含量較大的如人參皂苷Rb1等皂苷成分。人參皂苷Rb1和Rg1說(shuō)明可能存在一定促進(jìn)細(xì)胞脫顆粒的物質(zhì)。人參皂苷Rb1屬于人參二醇型皂苷，Rg1屬于人參三醇型皂苷，兩單體在血栓通注射液主要成分三七總皂苷中所占含量最大。部位1和單體1（未知）、人參皂苷Rd和人參皂苷Re的致敏性較弱，其中部位1的極性大，易溶于水，在三七總皂苷中所占比例較少;人參皂苷Re含量較少，且極性較大，易溶與水。綜上所述:血栓通