慶大霉素高產菌的選育及其發(fā)酵條件優(yōu)化研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、采用實驗室保藏的產慶大霉素的棘孢小單胞菌進行發(fā)酵試驗,首先對所得酵液進行了分析方法方面的研究,主要針對TLC檢測體系、HPLC以及離交純化方法進行了研究。通過較全面的優(yōu)化分析得到最佳TLC檢測體系為:將含羧甲基纖維素鈉0.2%,磷酸二氫鈉5%,和乙二胺四醋酸二鈉0.1%的溶液,與硅膠粉按照3:1的比例混合研磨0.5h后鋪板,采用氯仿:甲醇:氨水(25%)=5:4:3,靜置分層,上相飽和,下相展開,碘蒸氣顯色,檢測限為1.0μg。將發(fā)酵液

2、簡單濃縮后在該體系下檢測,可檢測到發(fā)酵液中的10個左右的組分,為微量組分的研究奠定基礎。另外,該體系下檢測到的GMC斑點規(guī)整,根據(jù)直徑和顏色可以快速估算出GMC的組分含量情況,與HPLC檢測結果進行比較發(fā)現(xiàn)兩種方法存在較好的一致性;在HPLC檢測體系對比分析中,結果表明采用甲醇:水:甲酸=74:21:5配制庚烷磺酸鈉溶液(4.0g/L)為流動相效果更優(yōu);采用大孔弱酸DK110型樹脂純化GM,洗脫峰更集中,較732型樹脂更便于發(fā)酵液的純化

3、和濃縮操作。 為得到優(yōu)良的慶大霉素(GM)高產菌,以Me07為出發(fā)菌,經(jīng)UV、硫酸二乙酯(DES)和微波誘變處理,以自身代謝終產物為篩子,采取抗性平板以及搖瓶動態(tài)選育兩種方式,結合TLC及HPLC檢測進行優(yōu)良突變菌株的篩選。篩選得到的產C1組分比例較高的優(yōu)良突變菌株Me07-1D15,生物效價為1400U/mL,較出發(fā)菌株(680U/ml)提高了2倍,其發(fā)酵液中C1含量最終檢測達到47.59%,并且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

4、 通過Plackett—Burman實驗設計篩選得到影響發(fā)酵水平的顯著因子為可溶性淀粉、豆餅粉、CoCl2、CaCO3。通過單因素分析及正交分析得到顯著因子最佳濃度為:淀粉60g/L,豆餅粉30g/L,氯化鈷0.008g/L,CaCO34g/L。對主要發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究,得出最佳發(fā)酵條件為:種齡選擇2d,接種量為12mL,發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.2,最佳裝液量為40mL(500mL搖瓶),培養(yǎng)溫度34℃,搖瓶轉速為250r/min,培

5、養(yǎng)周期8d,最佳條件下發(fā)酵水平達到1824U/mL。 過程控制研究從降低基質濃度和非營養(yǎng)刺激兩方面考察,結果表明適當減少培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分可以使產抗期提前;在發(fā)酵96h時進行水浴45℃處理可以使GM產量達到1685U/mL;在144小時添加0.6%的氯化鈉溶液,GM產量達到1715U/mL,是對照試驗的1.20倍;在96h添加4%乙醇,慶大霉素的產量達到1696U/ml,而當乙醇濃度達到5~6%時,對慶大霉素的合成有副作用,乙醇的

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