慶大霉素高產菌的選育及其發(fā)酵條件優(yōu)化研究.pdf

1、采用實驗室保藏的產慶大霉素的棘孢小單胞菌進行發(fā)酵試驗，首先對所得酵液進行了分析方法方面的研究，主要針對TLC檢測體系、HPLC以及離交純化方法進行了研究。通過較全面的優(yōu)化分析得到最佳TLC檢測體系為：將含羧甲基纖維素鈉0.2％，磷酸二氫鈉5％，和乙二胺四醋酸二鈉0.1％的溶液，與硅膠粉按照3：1的比例混合研磨0.5h后鋪板，采用氯仿：甲醇：氨水(25％)=5：4：3，靜置分層，上相飽和，下相展開，碘蒸氣顯色，檢測限為1.0μg。將發(fā)酵液

2、簡單濃縮后在該體系下檢測，可檢測到發(fā)酵液中的10個左右的組分，為微量組分的研究奠定基礎。另外，該體系下檢測到的GMC斑點規(guī)整，根據(jù)直徑和顏色可以快速估算出GMC的組分含量情況，與HPLC檢測結果進行比較發(fā)現(xiàn)兩種方法存在較好的一致性；在HPLC檢測體系對比分析中，結果表明采用甲醇：水：甲酸=74：21:5配制庚烷磺酸鈉溶液(4.0g/L)為流動相效果更優(yōu)；采用大孔弱酸DK110型樹脂純化GM，洗脫峰更集中，較732型樹脂更便于發(fā)酵液的純化

3、和濃縮操作。 為得到優(yōu)良的慶大霉素(GM)高產菌，以Me07為出發(fā)菌，經(jīng)UV、硫酸二乙酯(DES)和微波誘變處理，以自身代謝終產物為篩子，采取抗性平板以及搖瓶動態(tài)選育兩種方式，結合TLC及HPLC檢測進行優(yōu)良突變菌株的篩選。篩選得到的產C1組分比例較高的優(yōu)良突變菌株Me07-1D15，生物效價為1400U/mL，較出發(fā)菌株(680U/ml)提高了2倍，其發(fā)酵液中C1含量最終檢測達到47.59％，并且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

4、 通過Plackett—Burman實驗設計篩選得到影響發(fā)酵水平的顯著因子為可溶性淀粉、豆餅粉、CoCl2、CaCO3。通過單因素分析及正交分析得到顯著因子最佳濃度為：淀粉60g/L，豆餅粉30g/L，氯化鈷0.008g/L，CaCO34g/L。對主要發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究，得出最佳發(fā)酵條件為：種齡選擇2d，接種量為12mL，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.2，最佳裝液量為40mL(500mL搖瓶)，培養(yǎng)溫度34℃，搖瓶轉速為250r/min，培

5、養(yǎng)周期8d，最佳條件下發(fā)酵水平達到1824U/mL。 過程控制研究從降低基質濃度和非營養(yǎng)刺激兩方面考察，結果表明適當減少培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分可以使產抗期提前；在發(fā)酵96h時進行水浴45℃處理可以使GM產量達到1685U/mL；在144小時添加0.6％的氯化鈉溶液，GM產量達到1715U/mL，是對照試驗的1.20倍；在96h添加4％乙醇，慶大霉素的產量達到1696U/ml，而當乙醇濃度達到5～6％時，對慶大霉素的合成有副作用，乙醇的