大鼠內(nèi)嗅皮層微注射Orexin-A對(duì)睡眠—覺(jué)醒及空間記憶的影響.pdf

1、1998年發(fā)現(xiàn)的Orexin是一類(lèi)小分子神經(jīng)肽，也稱(chēng)hypocretin(hypocretin-1和hypocretin-2)，由外側(cè)下丘腦Orexin神經(jīng)元產(chǎn)生，有兩個(gè)單體：Orexin-A和Orexin-B。它們是來(lái)自同一基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。Orexin-A由33個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中有四個(gè)半胱氨酸形成鏈內(nèi)的二硫鍵。Orexin系統(tǒng)主要通過(guò)Orexin-1(OXIR)受體和Orexin-2(OX2R)受體發(fā)揮作用，兩受體均為G-蛋白偶聯(lián)受體，

2、OX1R和Orexin-A的親和力高于Orexin-B，而OX2R與Orexin-A和Orexin-B親和力相同。Orexin神經(jīng)元的投射幾乎遍布大腦的各個(gè)腦區(qū)，在維持覺(jué)醒中具有重要的意義，并且基因敲除小鼠或其受體基因突變可引起發(fā)作性睡眠病[1]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)Orexin神經(jīng)元可以投射到海馬(Hp)，與空間學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[2-4]。
　　 內(nèi)嗅皮層(entorhinalcortex，EC)在海馬和聯(lián)合皮層的雙向信息交流中起著

3、接替站的作用。EC淺層主要神經(jīng)元接受新皮層的輸入，投射至海馬。深層主要接受海馬CA1和下托的輸入，將其傳回至新皮層。EC參與形成的海馬-EC-新皮層環(huán)路在情景記憶的形成以及鞏固中發(fā)揮重要的作用[5]。EC可分為外側(cè)內(nèi)嗅皮層(LEC)和內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層(MEC)。目前認(rèn)為MEC主要參與傳遞和處理空間信息，在空間認(rèn)知功能中具有重要的意義[6-9]。
　　 本研究采用多導(dǎo)睡眠記錄和微注射技術(shù)，首先觀察內(nèi)嗅皮層內(nèi)，外源性的OrexinA對(duì)大

4、鼠睡眠.覺(jué)醒周期時(shí)間的影響，然后采用T-迷宮交替選擇模式初步觀察內(nèi)嗅皮層OrexinA對(duì)大鼠空間記憶的影響，之后采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察微注射OrexinA對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)功能及探索行為的影響。結(jié)果如下：
　　 1.Orexin受體在EC中的表達(dá)及在淺層中與reelin和calbindin的共表達(dá)
　　 對(duì)成年大鼠EC腦片進(jìn)行OX1R和OX2R免疫熒光化學(xué)檢測(cè)，觀察Orexin受體在EC中正常表達(dá)和在淺層中與reelin和calbin

5、din的共表達(dá)情況。結(jié)果顯示：淺層中OX1R的表達(dá)較深層要高得多，OX2R在EC中的表達(dá)模式與OX1R類(lèi)似；OX1R在reelin陽(yáng)性細(xì)胞和calbindin陽(yáng)性細(xì)胞中均有表達(dá)，表明OX1R可能廣泛表達(dá)于EC淺層的主要神經(jīng)元中。同時(shí)考慮到EC的reelin和calbindin信號(hào)在空間學(xué)習(xí)記憶中的重要作用，這也暗示了Orexin受體在空間學(xué)習(xí)記憶中的重要作用。
　　 2.OrexinA對(duì)睡眠-覺(jué)醒周期的影響
　　 在內(nèi)嗅

6、皮層腦區(qū)微注射不同劑量OrexinA，觀察大鼠睡眠.覺(jué)醒的變化。與ACSF自身對(duì)照相比，分別給大鼠內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層雙側(cè)微注射不同濃度的0.04nmol，0.06nmol，0.1nmol OrexinA后3小時(shí)11:00～12:00、12:00～13:00、13:00～14:00覺(jué)醒周期時(shí)間無(wú)影響(P>0.05)，給藥后24 h覺(jué)醒周期時(shí)間也無(wú)顯著差異(P>0.05)。及在11:00～14:003小時(shí)內(nèi)對(duì)覺(jué)醒時(shí)間無(wú)影響(P>0.05)，在11

7、:00～14:003 h內(nèi)NREM時(shí)間無(wú)影響(P>0.05)，在11:00～14:003小時(shí)后REM也無(wú)影響(P>0.05)，即對(duì)3h內(nèi)(11:00～14:00)大鼠總睡.眠覺(jué)醒時(shí)間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果顯示大鼠內(nèi)嗅皮層微注射OrexinA對(duì)它的睡眠，覺(jué)醒周期無(wú)影響。
　　 3.OrexinA受體阻斷劑SB-334867對(duì)睡眠-覺(jué)醒周期的影響
　　 在內(nèi)嗅皮層腦區(qū)微注射Orexin A受體阻斷劑SB-3348

8、67，觀察睡眠-覺(jué)醒周期變化。與DMSO自身對(duì)照相比，給大鼠內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層雙側(cè)微注射SB-334867(0.1nmol，5μl)后3小時(shí)11:00～12:00、12:00～13:00、13:00～14:00覺(jué)醒周期時(shí)間無(wú)影響(P>0.05)，給藥后24 h覺(jué)醒周期時(shí)間也無(wú)顯著差異(P>0.05)。及在11:00～14:003小時(shí)內(nèi)對(duì)覺(jué)醒時(shí)間無(wú)影響(P>0.05)，在11:00～14:003 h內(nèi)NREM時(shí)間無(wú)影響(P>0.05)，在11:

9、00～14:003小時(shí)后REM也無(wú)影響(P>0.05)，即對(duì)3 h內(nèi)(11:00～14:00)大鼠總睡-眠覺(jué)醒時(shí)間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。表明大鼠內(nèi)嗅皮層微注射SB-334867對(duì)睡眠.覺(jué)醒周期無(wú)影響。
　　 4.EC腦區(qū)OrexinA對(duì)空間記憶的影響
　　 1)OrexinA受體阻斷劑SB-334867對(duì)空間記憶的影響
　　 在內(nèi)嗅皮層腦區(qū)微注射，分別按兩種T-迷宮模式(保持模式，獲得模式)，觀察對(duì)空間記

10、憶的影響。連續(xù)訓(xùn)練大鼠，在內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層區(qū)微注射，對(duì)大鼠DMSO組間對(duì)照和OrexinA受體阻斷劑SB-334867給藥后的T-迷宮選擇正確次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。給大鼠內(nèi)嗅皮層雙側(cè)微注射SB-334867(6mM，0.5μl)，T-迷宮交替選擇正確次數(shù)明顯減少，正確率下降78%，有顯著性差異(p<0.05)。提示SB-334867影響了空間記憶，降低了空間記憶功能。即內(nèi)嗅皮層內(nèi)源性O(shè)rexinA促進(jìn)了空間記憶功能。
　　 2)敲低Orex

11、in A受體表達(dá)(RAAV2/1-OR1-shRNA-EGFP)對(duì)大鼠空間記憶的影響
　　 大鼠內(nèi)嗅皮層微注射手術(shù)，在內(nèi)嗅皮層腦區(qū)微注射空白對(duì)照組SCR(RAAV2/1-SCR-shRNA-EGFP)及干擾組OR1(RAAV2/1-OR1-shRNA-EGFP)，觀察內(nèi)嗅皮層敲低Orexin A受體表達(dá)后對(duì)大鼠空間記憶的影響。以SCR對(duì)照在內(nèi)嗅皮層微注射OR1干擾病毒，分兩組，對(duì)大鼠SCR組間對(duì)照組和OR1干擾組分別21天后開(kāi)始

12、T-迷宮訓(xùn)練，訓(xùn)練持續(xù)21天。對(duì)其結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，交替選擇正確次數(shù)減少，正確率下降48%，有顯著性差異(p<0.05)。提示，敲低Orexin A受體表達(dá)，降低了空間記憶功能。即內(nèi)嗅皮層OrexinA受體參與了且提高了空間記憶能力。
　　 5.術(shù)后內(nèi)嗅皮層微注射藥物對(duì)大鼠探索行為及運(yùn)動(dòng)功能的影響
　　 大鼠內(nèi)嗅皮層套管埋置手術(shù)恢復(fù)后，在內(nèi)嗅皮層腦區(qū)微注射對(duì)照ACSF，DMSO以及藥物組Orexin A及其受體阻斷劑SB-3

13、34867，觀察對(duì)探索行為和運(yùn)動(dòng)功能的影響。在內(nèi)嗅皮層分別微注射藥物(ACSF，DMSO，orexin A，SB-334867)分四組，對(duì)大鼠ACSF，DMSO組間對(duì)照和OrexinA及受體阻斷劑SB-334867給藥15min后在曠場(chǎng)中的站立次數(shù)和所走的格子數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。給大鼠內(nèi)嗅皮層微注射(0.1nmol，0.5μl)Orexin A，大鼠的站立次數(shù)和行走的格子數(shù)無(wú)明顯變化，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；微注射(6mM，0.5μl)O

14、rexin A受體阻斷劑SB-334867，大鼠站立次數(shù)和行走的格子數(shù)無(wú)明顯變化，無(wú)顯著差異(P>0.05)。表明術(shù)后內(nèi)嗅皮層微注射藥物對(duì)大鼠探索行為及運(yùn)動(dòng)功能無(wú)影響。
　　 綜上所述，本研究結(jié)果表明：一，EC區(qū)OR1在reelin陽(yáng)性和calbindin陽(yáng)性神經(jīng)元中都有表達(dá)。二，EC微注射不同劑量OrexinA對(duì)大鼠的睡眠-覺(jué)醒周期無(wú)影響。三，EC微注射Orexin A受體阻斷劑SB-334867對(duì)大鼠睡眠.覺(jué)醒周期無(wú)影響。四