抗TfR抗體偶聯物靶向抗瘤效應及其雜交瘤細胞株輕鏈基因分析.pdf

1、目的：本課題設計將姜黃素作為抗腫瘤藥物在光照條件下激發(fā)成為光敏劑，通過修飾后偶聯特異性的抗TfR 抗體協(xié)同發(fā)揮雙向抗癌效應。為了延長藥物的半衰期，進一步探索姜黃素的光學特性，比較了TfR 抗體與光敏劑聯合應用的不同方法，檢測其偶聯效率及體外功能，探討作用機制，并據此設計制備納米化中藥光敏劑-抗TfR 單抗偶聯物，為腫瘤的多重定位顯像與靶向治療提供實驗依據。在此基礎上還分析了從同一雜交瘤細胞株中擴增出的三條輕鏈基因，為實現抗TfR基因工程

2、改造與基因工程抗體靶向偶聯物抗瘤效應研究奠定基礎。
　　 方法：
　　 1.抗TfR 單抗-偶聯物的制備及其抗瘤效應測定；
　　 2.通過IMGT和NCBI 數據庫在線分析VH和VL基因序列；
　　 3.經由InsightⅡ軟件模擬抗TfR 單抗Fabs 段分子結構。
　　 結果：
　　 1.抗TfR 單抗-偶聯物的制備及其抗瘤效應
　　 （1）普通光照對細胞培養(yǎng)無影響，姜黃素在電

3、鏡下能發(fā)出土黃色熒光，在燈光照射下對腫瘤細胞原有的殺傷作用增強，熒光顯微鏡下可見Cur 能被肝癌細胞內吞；
　　 （2）化學偶聯法制備的抗TfR 單抗-姜黃素偶聯物，其抗體效價較單抗有所降低，但對HepG2 肝癌細胞的殺傷作用比姜黃素或抗TfR 單抗單獨作用時明顯增強，與姜黃素+單抗混合物殺傷作用類似；
　　 （3）光敏化姜黃素-抗TfR 單抗靶向性納米粒的性質、特征均符合納米級顆粒：
　　 1）薄膜分散法制備的

4、脂質體包封率穩(wěn)定；
　　 2）透射電鏡顯示Cur-NP-PEG-Ab 形態(tài)穩(wěn)定，屬于納米級；
　　 3）FCM分析結果表明Cur-NP-PEG-Ab與鼠源單抗具有相似的結合率；
　　 4）FCM分析結果表明在光照條件下Cur-NP-PEG-Ab 能影響肝癌細胞的周期S 期，并促進其凋亡；
　　 5）Cur-NP-PEG-Ab 使線粒體電位降低和活性氧產生增加。
　　 2.抗TfR 抗體基因分析

5、r>　　 在分泌抗TfR單克隆抗體的同一株雜交瘤細胞中擴增出三條輕鏈和一條有功能的重鏈可變區(qū)基因，功能性的VH基因片段經DNA凝膠電泳鑒定片段大小與理論值414bp相符，DNA測序顯示該基因有完整閱讀框架。得到的三條輕鏈通過IMGT和NCBI分析確認均來自于不同的基因家族：VL-f1引物擴增得到MOPC21骨髓瘤中的非功能內源性輕鏈；由VL-f2引物擴增出有功能的輕鏈基因（命名為Vκ2），屬于IGKV4-59*01家族，可變區(qū)長318

6、bp，信號肽長66bp；由VL-f3引物擴增出的功能性輕鏈基因（命名為Vκ3），屬于IGKV6-17*01，可變區(qū)長324bp，信號肽長60bp。NCBI數據庫報道Vκ3序列與許多單抗輕鏈可變區(qū)相同，也與骨髓瘤MPC11有功能的重排等位基因完全匹配。3D分子模擬顯示根據TfR單抗可變區(qū)模擬的Fabs結構，兩條不同輕鏈和同一重鏈偶聯制備的Fabs段都具有完整的功能域和結合凹槽。
　　 結論：本研究通過制備可生物降解的mPEG-PL

7、GA-CUR-NPs納米顆粒，并通過體外實驗初步研究了改造的納米粒生物學作用，獲得了有意義的研究結果，研究表明：①制備的Cur-NP-PEG-Ab納米粒符合納米級別，具有較高的載藥量和包封率；②Cur-NP-PEG-Ab與靶細胞結合率和親本鼠源性抗體與HepG2細胞結合率相近；③Cur-NP-PEG-Ab在光照下對腫瘤細胞殺傷作用明顯增強，提示該納米粒在完成靶向殺傷腫瘤的同時，能發(fā)揮光敏劑的效應；④首次將Cur-NP-PEG-Ab中的姜