PDK1siRNA及UCN-01對食管癌EC9706細胞PDK1基因表達影響的研究.pdf

1、我國食管癌發(fā)病率位居世界首位，開發(fā)新型藥物、分子靶向治療食管癌成為研究的熱點。3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent proteinkinase1，PDK1)屬于AGC激酶家族，其介導調節(jié)的PI3K/Akt信號轉導通路異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。PDK1是Akt、p70-S6K、RSK、PKC等AGC激酶活化環(huán)的主要上游激酶，作為Akt上游激酶，1997年被A1essi DR等分

2、離鑒定，可以磷酸化Akt的Thr308位點使其激活，活化的Akt調節(jié)其下游的多條路徑，繼而影響糖類代謝、蛋白轉錄翻譯、細胞增殖、遷移以及抗凋亡。PDK1可能成為當前腫瘤治療研究中新的靶點。
　　 RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種轉錄后的基因沉默現象，具有高效、高特異性等優(yōu)點，已經被廣泛應用于基因功能鑒定、基因表達轉錄后調控等研究領域，同時也為多種疾病特別是惡性腫瘤的基因治療開拓了新的思路。UCN-0

3、1(7-hydroxy staurosporine)是目前已有的文獻報道中研究較成熟的PDK1抑制劑，是星孢菌素(staurosporine)的7α羥基衍生物。UCN-01能通過競爭性抑制PDK1的ATP結合位點而抑制其激酶活性，從而使下游Akt磷酸化水平下降，干擾下游信號轉導進而影響細胞代謝、增殖和凋亡，引起細胞毒作用。本研究采用PDK1 siRNA及其抑制劑UCN-01沉默食管癌EC9706細胞中PDK1基因，阻斷P13K/Akt信

4、號轉導通路，觀察下游Akt蛋白磷酸化水平的變化，及其對細胞增殖、凋亡的影響，為尋求食管癌的分子靶向治療途徑提供實驗依據。
　　 材料和方法:
　　 1．高分化人食管鱗癌EC9706細胞株于37℃、5％CO2孵育箱中培養(yǎng)，以RNAi-Mate轉染試劑介導PDK1 siRNA轉染細胞，或以50nM、100nM、200nM濃度的UCN-01分別作用于細胞24h、48h、72h。
　　 2．采用RT-PCR技術檢測各組細

5、胞中PDK1 mRNA的表達。
　　 3．采用Western Blot技術及免疫細胞化學法檢測各組細胞中PDK1、Akt、p-Akt的蛋白表達。
　　 4．采用MTT法檢測各組細胞生長抑制率。
　　 5．采用TUNEL及流式細胞術檢測各組細胞凋亡的變化情況。
　　 6．統(tǒng)計學處理：應用統(tǒng)計軟件SPSS13.0分析實驗數據，檢驗水準α=0.05。
　　 結果:
　　 1．siRNA轉染效率檢

6、驗：不同濃度Negative control FAM-siRNA轉染EC9706細胞，6h后在熒光顯微鏡下觀察，濃度100nM組轉染效率最高，后續(xù)siRNA轉染實驗均采用此濃度。
　　 2．PDK1 siRNA的篩選：與細胞對照組相比，Negative control siRNA組和RNAi-Mate組對PDK1 mRNA表達沒有影響，且二者之間無明顯差異（P＞0.05）。三條PDK1 siRNA轉染EC9706細胞的PDK1

7、mRNA水平均低于細胞對照組(．P＜0.05)，其中PDK1 siRNA1抑制效率最高(P＜0.05)，篩選出PDK1 siRNA1序列進行后續(xù)試驗。
　　 3．PDK1 siRNA、UCN-01對PDK1 mRNA表達的影響：PDK1 siRNA1轉染EC9706細胞可下調PDK1 mRNA表達，以轉染72h較顯著(P＜0.05); UCN-01也能夠下調EC9706細胞PDK1 mRNA表達，且具有濃度依賴性和作用時間依賴性

8、(P＜0.05); PDK1 siRNA1下調細胞PDK1mRNA表達的能力強于濃度200nM的UCN-01(P＜0.05)。
　　 4．PDK1 siRNA、UCN-01對PDK1蛋白表達及Akt磷酸化水平的影響：PDK1siRNA1可下調PDK1、p-Akt蛋白表達，以轉染72h較顯著(P＜0.05); UCN-01也能夠下調細胞PDK1、p-Akt蛋白表達，且具有濃度依賴性和作用時間依賴性(P＜0.05); PDK1 si

9、RNA1下調細胞PDK1、p-Akt蛋白表達的能力比濃度200nM的UCN-01強(P＜0.05): PDK1 siRNA、UCN-01對于Akt蛋白表達的影響無統(tǒng)計學差異(P＞0.05）。
　　 5．PDK1 siRNA、UCN-01對EC9706細胞增殖的影響：與各對照組相比，PDK1 siRNA、UCN-01可提高細胞生長抑制率，且具有時間依賴性(P＜0.05)；UCN-01對生長抑制率的影響還具有濃度依賴性(P＜0.05

10、); PDK1 siRNA對細胞生長抑制率的影響強于濃度200nM的UCN-01(P＜0.05)。
　　 6．PDK1 siRNA、UCN-01對EC9706細胞凋亡的影響：PDK1 siRNA、UCN-01作用于EC9706細胞72h后早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞比例增加(P＜0.05）；UCN-01對EC9706細胞凋亡的影響具有濃度依賴性(P＜0.05); PDK1 siRNA1促進EC9706細胞凋亡的能力比濃度200nM

11、的UCN-01更強（P＜0.05）。
　　 結論:
　　 1．PDK1 siRNA能有效沉默EC9706細胞PDK1基因的表達，下調其下游Akt蛋白磷酸化水平，從而阻斷PI3K/PDK1/Akt信號轉導通路，抑制EC9706細胞增殖，誘導細胞凋亡，表明PDK1可能是食管癌分子治療的有效靶點
　　 2．PDK1化學抑制劑UCN-01能夠抑制EC9706細胞PDK1基因表達及Akt蛋白磷酸化，阻斷P13K/PDK1/