禽致病性大腸桿菌aroA和luxS雙缺失株的構(gòu)建及其菌蛻疫苗的制備.pdf

1、禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC)引起的禽類急性、慢性傳染病的總稱，以氣囊炎、肝周炎和心包炎為主要特征，是養(yǎng)禽業(yè)常見的傳染病。
　　目前該病的防控主要通過抗生素治療及疫苗免疫，但抗生素濫用導致的耐藥和藥殘問題，嚴重威脅養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全;而傳統(tǒng)疫苗，由于禽大腸桿菌的血清型較多，不能對該病提供有效防控，亟需開展新型疫苗的研制。菌蛻（Bacter

2、ial ghost，BGs）是通過調(diào)控噬菌體裂解基因E在革蘭氏陰性菌中表達而形成無細胞質(zhì)及細胞器的細菌空殼，是一種關(guān)于疫苗、藥物及呈遞系統(tǒng)的新技術(shù)。與傳統(tǒng)疫苗相比，菌蛻疫苗具有制備簡單、使用安全、運輸方便等優(yōu)點。
　　本研究通過構(gòu)建禽致病性大腸桿菌DE17(O2血清型)aroA及aroA luxS雙缺失疫苗株，并開展菌蛻疫苗的研制及免疫效果評價，以期為禽大腸桿菌病的防控提供參考。
　　1)禽致病性大腸桿菌流行病學調(diào)查

3、　　2015年，自江蘇、安徽、福建等省部分養(yǎng)殖場分離、鑒定139株大腸桿菌，其中從病禽中分離到20株APEC。血清型檢測結(jié)果表明，O1血清型（11株）、O2血清型（14株）和O78血清型（14株）占分離菌株總數(shù)的28％， APEC總數(shù)的50％。表明O1、O2、 O78血清型仍然為APEC的優(yōu)勢血清型。
　　參照美國臨床和實驗室標準化研究所(CLSI)制定的抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準，選取14種抗菌藥對分離菌株進行耐藥性檢測，結(jié)果表

4、明，99％以上分離菌株對紅霉素、克林霉素和利福平耐受。此外，86％的分離菌株對10種以上抗生素耐受，57.3％的菌株對13種藥物都耐受。
　　對分離菌株的毒力基因檢測結(jié)果表明:iucD(82％)，tsh(58.6％)，iss(55％)和irp2(44.6％)有較高的分布率，而cva/CVI(19.3％)，aatA(14.3％)，papc(4.3％)和vat(6.7％)毒力基因分布率均低于20％。表明iss、tsh、iucD和irp

5、2為APEC的保守基因，推測其可能在APEC致病過程中發(fā)揮重要作用。
　　2) DE17ΔaroA和DE17ΔaroAΔluxS的構(gòu)建及生物學特性研究本研究通過同源重組技術(shù)，構(gòu)建了DE17 aroA缺失株（DE17ΔaroA）和DE17 aroA luxS雙缺失株(DE17ΔaroAΔluxS)，并對其生物學特性進行研究。
　　以7日齡櫻桃谷鴨作為實驗動物進行LD50測定，結(jié)果表明DE17的LD50為1×104CFU，DE1

6、7ΔaroA的LD50為3.8×105CFU， DE17ΔaroAΔluxS的LD50為1.76×106CFU，與野生株相比，缺失株毒力分別下降了38和176倍。
　　對雞胚成纖維細胞(DF-1)的黏附、入侵結(jié)果表明，與野生株DE17相比，缺失株DE17Δ aroA的黏附、入侵分別下降了25.8％和29.3％(p＜0.05)，而DE17ΔaroAΔluxS的黏附、入侵下降了36.5％和42.5％(p＜0.01)。
　　體內(nèi)分

7、布結(jié)果顯示:與野生株DE17相比，缺失株DE17ΔaroA和DE17ΔaroAΔluxS在櫻桃谷鴨肝臟、脾臟和血液中的載菌量下降了743、1000、1700倍和8400、11300倍。表明缺失aroA和luxS基因顯著降低其致病性。
　　此外，aroA基因缺失或者aroA luxS基因雙缺失，細菌運動性下降。
　　上述結(jié)果表明，缺失aroA和luxS基因后，APEC的毒力下降，致病性降低。
　　3)菌蛻質(zhì)粒的構(gòu)建

8、>　　在本實驗室前期構(gòu)建的pUC19-ΔCI857-E-rmB溶菌質(zhì)粒和pUC19-CI857-E-rrnB-pl-SN溶菌質(zhì)粒基礎上，構(gòu)建了pUC19-ΔCI857-E-rrnB-pl-SN溶菌質(zhì)粒，實現(xiàn)了其可在37℃進行菌蛻的制備，提高了菌蛻的制備效率。
　　利用構(gòu)建的質(zhì)粒制備DE17菌蛻，結(jié)果表明DE17可以在37℃正常培養(yǎng)，滅活效果檢測表明滅菌效率可達99.99％。對制備菌蛻的電鏡觀察結(jié)果表明，成功制備不含胞質(zhì)的菌蛻。

9、r>　　為了提高菌蛻疫苗的安全性，加強菌蛻的滅活效果，本研究通過pUC19-ΔCI857-E-rrnB-pl-SN溶菌質(zhì)粒中的SN實現(xiàn)對DE17菌蛻基因組的完全降解。同時采用菌蛻凍干或添加40μg/mL慶大霉素的方法，實現(xiàn)對菌蛻的100％滅活，保證了菌蛻疫苗的安全性。
　　4)免疫保護實驗
　　為了評價菌蛻疫苗的免疫效果，本研究對7日齡櫻桃谷鴨分別免疫甲醛滅活疫苗和菌蛻疫苗，2周后進行攻毒，評價各組疫苗的免疫保護率。

10、　　結(jié)果表明，利用DE17，DE17ΔaroA和DE17ΔaroAΔluxS制備的甲醛滅活疫苗（加佐劑），對櫻桃谷鴨的免疫保護率分別為50％，70％和80％，表明DE17缺失aroA和luxS基因后具有更高的免疫原性。
　　利用DE17和DE17ΔaroAΔluxS菌株制備的菌蛻疫苗，在不加佐劑情況下，免疫櫻桃谷鴨后，仍能提供80％的免疫保護率，而不加佐劑的甲醛滅活疫苗僅能提供30％的免疫保護，表明菌蛻疫苗不但具有較高的免疫保護性