NADPH氧化酶3源性活性氧在游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗發(fā)生中的作用機理研究.pdf

1、2型糖尿病的病理生理特點是胰島素分泌不足或利用障礙，除血糖升高(Hyperglycemia)外，脂代謝紊亂也是糖尿病伴隨的特征之一。游離脂肪酸(Freefattyacids，F(xiàn)FA)是聯(lián)系脂代謝紊亂和胰島素抵抗或高胰島素血癥的重要環(huán)節(jié)。肥胖引發(fā)的FFA水平升高可通過多種途徑影響胰島素的作用及葡萄糖代謝，在胰島素抵抗的病理過程中占有重要的地位。肝臟是胰島素的重要靶器官之一，肝臟的胰島素抵抗在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。研究已表

2、明，高FFA誘發(fā)的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致肝臟胰島素抵抗的重要原因。氧化應(yīng)激(Oxidativestress)是指機體在遭受各種有害刺激時體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(Reactiveoxygenspecies，ROS)和活性氮自由基(Reactivenitrogenspecies，RNS)的產(chǎn)生過多，氧化程度超出抗氧化系統(tǒng)對氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。機體內(nèi)有多種酶體參與了ROS的生成，如NADPH氧化酶(NADP

3、Hoxidase，NOX)、黃嘌呤氧化酶(Xanthineoxidase)、線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)及脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX)等，一些研究認(rèn)為NOX是肝臟內(nèi)生成ROS的主要酶體。最早在吞噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的NOX是由多個亞基組成的酶復(fù)合體，包括胞膜組分：細(xì)胞色素b558(gp91PHOX和p22PHOX)和胞漿組分：p47PHOX、p

4、67PHOX及Rac（小的GTP結(jié)合蛋白）共五個亞組分。gp91PHOX（有NADPH、heme、FAD的潛在結(jié)合位點）和p22PHOX是NOX的酶促核心，它們受p47PHOX及Rac的調(diào)節(jié)。近幾年已發(fā)現(xiàn)NOX的同源家族有NOX1、NOX2(gp91PHOX)、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1(Dualoxidase1)和Duox2等成員。研究顯示肝臟細(xì)胞主要表達NOX3。雖然實驗研究已證實FFA在胰島素抵抗發(fā)生過程中起著重要的

5、作用，但其作用的分子機理尚不清楚，還有待闡明。
　　 本研究旨在探討NOX3源性ROS在FFA誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗發(fā)生中的作用機理。首先我們用不同濃度(0.15-0.35mmol/L)Palmitate（棕櫚酸）處理人肝臟細(xì)胞HepG2，通過DCFH-DA熒光染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS水平的改變。結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)條件相比，Palmitate導(dǎo)致HepG2細(xì)胞中ROS水平的顯著升高，其作用具有濃度和時間依賴性。分別用產(chǎn)生RO

6、S途徑的抑制劑如NOX抑制劑DPI（Diphenyleneiodoniumcloride）、線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體抑制劑Rotenone、一氧化氮合酶抑制劑L-NAME和黃嘌呤氧化酶抑制劑Oxypurinol預(yù)處理后的結(jié)果顯示，DPI和Rotenone處理組的ROS水平顯著降低，其中DPI降低ROS水平的作用最為顯著，而其他抑制劑處理組的ROS水平無明顯變化。提示NOX是高FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要來源。進一步應(yīng)用Weste

7、mblot分析NOX亞組分的表達變化。結(jié)果表明，HepG2表達NOX3、p22PHOX、p47PHOX和Rac-1。NOX3和p47PHOX的表達在0.25mmol/LPalmitate處理后顯著升高，p22PHOX和Rac-1則無顯著性改變。觀察Palmitate對NOX3活性的調(diào)節(jié)機理的結(jié)果表明，在0.25mmol/LPalmitate作用下，HepG2細(xì)胞的NOX3活性主要是通過p47PHOX的膜移位來調(diào)節(jié)。用檢測細(xì)胞內(nèi)糖原合成和

8、培養(yǎng)上清中葡萄糖的含量來觀察細(xì)胞的胰島素抵抗。結(jié)果顯示，Palmitate處理后HepG2細(xì)胞內(nèi)糖原合成量顯著降低，細(xì)胞培養(yǎng)上清中葡萄糖的濃度顯著升高，提示Palmitate誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗。為了確定NOX3源性ROS在HepG2產(chǎn)生胰島素抵抗中的作用，我們采取“失去功能”的策略，將NOX3-siRNA轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，獲得低表達NOX3水平的HepG2細(xì)胞。分析比較這些HepG2細(xì)胞和對照HepG2細(xì)胞（未轉(zhuǎn)入NO

9、X3-siRNA）中ROS水平與胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。經(jīng)NOX3-siRNA轉(zhuǎn)染抑制NOX3表達后，Palmitate所引起的ROS升高和胰島素抵抗均受到抑制。說明NOX3參與了FFA引起的ROS的生成和胰島素抵抗。在此基礎(chǔ)上，我們進一步探討FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗的機理。結(jié)果顯示，0.25mmol/LPalmitate處理HepG2細(xì)胞后，伴隨NOX3表達與ROS水平的升高，磷酸化的p38MAPK、PTEN、JNK、IRS1增

10、多，胰島素信號通路中的AKT、GSK、FOXOl的磷酸化水平下降。表明FFA通過NOX3介導(dǎo)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，其機理涉及到p38MAPK/PTEN、JNK和PI-3K/AKT信號通路。
　　 我們用db/db小鼠作為胰島素抵抗模型進一步證實NOX3源性ROS在FFA誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗發(fā)生中的作用機理。油紅O染色結(jié)果顯示db/db小鼠肝臟中脂肪堆積。與正常對照小鼠相比，db/db小鼠血清中FFA、GLU

11、濃度顯著升高。以血清中的MDA水平、肝臟中ROS生成和NOX3表達作為評價氧化應(yīng)激的指標(biāo)，結(jié)果表明，db/db小鼠MDA水平顯著升高，肝臟中NOX3表達增強，ROS生成增多。此外，db/db小鼠血清胰島素和糖化血紅蛋白水平明顯高于正常對照小鼠，提示db/db小鼠發(fā)生了胰島素抵抗。用檢測肝組織中糖原含量進一步分析db/db小鼠肝臟胰島素抵抗?fàn)顩r，結(jié)果顯示db/db小鼠肝臟糖原含量顯著低于正常對照小鼠，表明db/db小鼠肝臟處于胰島素抵抗?fàn)?/p>

12、態(tài)。與體外結(jié)果相一致，p38MAPK/PTEN、JNK和PI-3K/AKT信號通路參與了肝臟胰島素抵抗的發(fā)生過程。
　　 綜上所述，本研究得出以下結(jié)論：1、Palmitate主要通過上調(diào)NOX3的表達和活性顯著提高HepG2細(xì)胞中的ROS水平；2、Palmitate通過引起p47PHOX膜移位促進NOX3的活化；3、高濃度Palmitate可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗，而干擾NOX3的表達可以抑制Palmitate引起的胰