黃芩苷生物合成途徑中關鍵酶基因的克隆與序列分析.pdf

1、黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物界的次生代謝產(chǎn)物，它對植物的生理生態(tài)功能具有重要作用，如花卉著色、紫外線防護、化感作用和病理防御。黃酮類化合物通過苯丙烷類途徑合成，并且該途徑上的大多數(shù)酶已經(jīng)被確定。黃芩是一種主產(chǎn)于亞洲的多年生草本植物，其根被作為傳統(tǒng)中藥用于炎癥和細菌性疾病的治療。在黃芩類中有幾種常用的藥用品種，包括正品黃芩和粘毛黃芩，它們的主要活性成分是黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等黃酮類化合物。近年的研究證實黃芩黃酮能抗艾滋病

2、毒和白血病毒，有助于治療乳腺癌、肝癌、胰腺癌和前列腺癌等，還有清除自由基的功效。然而，關于黃芩黃酮類化合物生物合成關鍵酶的信息還罕見報道。 在本研究中，通過cDNA末端快速擴增技術(RACE)成功克隆了粘毛黃芩類黃酮生物合成途徑中三個關鍵酶基因：苯丙氨酸解氨酶、查爾酮合成酶和黃酮醇3—羥化酶。 克隆到一條苯丙氨酸解氨酶基因cDNA全長，命名為Svpal，并登錄到Genbank獲得了基因序列登錄號FJ432698。Svpa

3、l全長2406bp，包括5’和3’非翻譯區(qū)、polyA尾巴和一個編碼2133bp的ORF，它編碼一條711個氨基酸殘基的PAL蛋白質，預測分子式為C3405H5447N949O1038S28，分子量為77.180kDa，等電點為5.97。TargetP分析結果顯示SvPAL定位于細胞質基質，且無轉運肽。ProtScale預測SvPAL是疏水性蛋白質。通過GOR預測SvPAL的二級結構，結果顯示SvPAL含有43.88％的α—螺旋，12.

4、10％的延伸鏈和44.02％的無規(guī)則卷曲。分析SvPAL蛋白的三級結構顯示，SvPAL，亞基包含多個重要的功能結構域，如MIO位點等。用Neighber—joining方法構建了系統(tǒng)進化樹，SvPAL很清楚地和其他植物中的PAL合為一簇，從分子水平上驗證了所選植物的PAL可能起源于同一個祖先。 克隆到一條查爾酮合成酶基因cDNA全長，命名為Svchs，并登錄到Genbank獲得了基因序列登錄號EU386767。Svpal全長16

5、49bp，包括5’和3’非翻譯區(qū)、polyA尾巴和一個編碼1170bp的ORF，它編碼一條390個氨基酸殘基的CHS蛋白質，預測分子式為C1898H3012N506O565S19，分子量為42.566kDa，等電點為5.79。TargetP分析結果顯示SvCHS定位于細胞質基質，且無轉運肽。ProtScale預測SvCHS是疏水性蛋白質。通過GOR預測SvCHS的二級結構，結果顯示SvCHS含有37.44％的α—螺旋，18.97％的延伸

6、鏈和43.59％的無規(guī)則卷曲。分析SvCHS蛋白的三級結構顯示，SvCHS亞基包含多個重要的功能結構域，如丙二酰CoA結合位點、CHS催化中心等。用Neighber—joining方法構建了系統(tǒng)進化樹，SvCHS很清楚地和其他植物中的CHS合為一簇，從分子水平上驗證了所選植物的CHS可能起源于同一個祖先，也反映出黃酮化合物為聚類指標的進化生物學意義，從而說明類黃酮代謝關鍵酶的CHS蛋白在自然演化進程中的遺傳保守性和功能穩(wěn)定性。

7、克隆到一條黃酮醇3—羥化酶基因cDNA全長，命名為Svf3h，并登錄到Genbank獲得了基因序列登錄號FJ432699。Svf3h全長1317bp，包括5’和3’非翻譯區(qū)、polyA尾巴和一個編碼1050bp的ORF，它編碼一條350個氨基酸殘基的F3H蛋白質，預測分子式為C1751H2732N474O524S18，分子量為39.382kDa，等電點為5.41。TargetP分析結果顯示SvF3H定位于細胞質基質，且無轉運肽。Prot

8、Scale預測SvF3H是疏水性蛋白質。通過GOR預測SvF3H的二級結構，結果顯示SvF3H含有31.43％的α—螺旋，22.29％的延伸鏈和46.29％的無規(guī)則卷曲。分析SvF3H蛋白的三級結構顯示，SvF3H亞基包含多個重要的功能結構域，如Fe2+結合位點和2-酮戊二酸結合位點等。用Neighber—jioining方法構建了系統(tǒng)進化樹，SvF3H很清楚地和其他植物中的F3H合為一簇，從分子水平上驗證了所選植物的F3H可能起源于同