Wnt7a基因?qū)Υ笫蠊撬栝g充質(zhì)干細胞增殖及向神經(jīng)元樣細胞分化影響的研究.pdf

1、研究背景:
　　目前,脊髓損傷后治療依然存在重重困難,主要是神經(jīng)組織自身修復能力有限。據(jù)文獻報道,胚胎干細胞和神經(jīng)干細胞可以作為種子細胞修復神經(jīng)組織,然而其來源有限,并且其獲取受倫理道德的制約。近年來,具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)由于易于獲取而被廣泛應用于細胞移植損傷修復,但是脊髓損傷區(qū)營養(yǎng)因子分泌缺乏、誘導環(huán)境條件不足,導致修復效果不理想。因此,保持MSCs的長期存

2、活、提高其向神經(jīng)元細胞分化率非常重要。
　　wnt家族在腫瘤、肌肉再生、神經(jīng)系統(tǒng)修復、生殖系統(tǒng)、肢干背腹形成和后肢發(fā)育、軟骨與眼角膜修復、心臟發(fā)育方面均發(fā)揮重要作用。Wnt7a是wnt家族的重要成員之一。研究證明,更新的衛(wèi)星干細胞中wnt7a表達上調(diào),Wnt7a能夠刺激衛(wèi)星干細胞的對稱延伸,促進衛(wèi)星細胞和衛(wèi)星干細胞的增殖。在創(chuàng)傷角膜中,LyuJ等[1]發(fā)現(xiàn)Wnt7a表達能夠迅速被誘導,并啟動角膜上皮細胞的增殖,從而增強創(chuàng)傷愈合。同

3、時,wnt7a在神經(jīng)發(fā)展、軸突和突觸生長中發(fā)揮著重要作用。Ciani和其他學者[2-4]初步研究發(fā)現(xiàn)Wnt7a能夠誘導軸突延伸和分支,對促進神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元方向分化有重要作用。因此,我們推斷Wnt7a在組織修復中可能具有重要作用。
　　研究目的:
　　1.構建Wnt7a腺病毒表達載體轉(zhuǎn)染MSCs,研究Wnt7a過表達對MSCs增殖的影響及機制。
　　2.研究Wnt7a過表達對MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化的影響,以期為

4、臨床應用MSCs治療脊髓損傷提供初步的實驗基礎。
　　研究方法:
　　1.采用密度梯度離心法并聯(lián)合貼壁培養(yǎng)進行SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離、純化,流式細胞儀檢測細胞表面標記分子,通過成骨誘導分化進行鑒定。
　　2.通過PCR方法克隆Wnt7a基因,通過同源重組構建腺病毒表達質(zhì)粒,通過PCR進行陽性克隆鑒定,并通過測序鑒定篩選出的陽性克隆,利用Western blot檢測Wnt7a基因表達。在大腸桿菌中擴增陽性克隆質(zhì)粒和

5、腺病毒輔助質(zhì)粒,然后在293T細胞中進行同源重組進行病毒包裝。通過CsCl密度梯度離心進行病毒的純化,然后通過試劑測定病毒的滴度。
　　3.將大鼠骨髓間充干細胞培養(yǎng)于96孔板,按MOI=60、80、100進行腺病毒感染預實驗。
　　4.將MSCs細胞鋪到24孔板,16h后按MOI=80感染W(wǎng)nt7a腺病毒和對照腺病毒,感染后觀察熒光情況,利用MTT實驗檢測細胞的增殖情況。
　　5.Western blot檢測Wnt7a

6、表達腺病毒感染MSCs后Wnt7a、β-catenin和CyclinD1的表達。
　　6.MSCs細胞向神經(jīng)元樣細胞誘導,將實驗細胞分成3組:MSCs組、MSCs+對照病毒組、MSCs+Wnt7a腺病毒組,每孔加入1mLDMEM/低糖+10ng/mLbFGF培養(yǎng)過夜,換液后每孔加入1mLDMEM/低糖+200μmol/LBHA液,誘導5h,吸走誘導液,加入300μL/孔的4％多聚甲醛固定25min,免疫熒光檢測MSCs細胞向神經(jīng)元

7、樣細胞誘導后NSE蛋白表達。
　　結果:
　　1.MSCs細胞生長狀態(tài)良好,貼壁生長,呈長梭形;細胞表面CD34、CD45陰性表達,CD44、CD90陽性表達。成骨誘導后堿性磷酸酶染色見鈣顆粒。
　　2.通過PCR方法克隆Wnt7a基因獲得1085bp片段,與NCBIgenebank中片段大小基本相符。通過PCR陽性克隆鑒定和測序證明構建的腺病毒表達質(zhì)粒完全正確。Western blot檢測Wnt7a表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293

8、T細胞后的表達,在72KD處有陽性條帶,其大小和Wnt7a-GFP-Flag融合蛋白(69KD)相吻合。通過試劑盒測定對照腺病毒的滴度是7.8×1010vp/mL,Wnt7a過表達病毒的滴度是1.3×1010vp/mL。
　　3.熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)構建的對照腺病毒在MOI=80時感染效果最好,Wnt7a過表達病毒在MOI=100時感染效果最好。
　　4.MTT實驗結果顯示,在第1、2天,MSCs+Wnt7a腺病毒組細胞OD

9、(570)值與MSCs+對照腺病毒組細胞、MSCs組細胞相比均沒有差異,MSCs+對照腺病毒組細胞和MSCs組細胞相比也沒有差異。在第3、4天,MSCs+Wnt7a腺病毒組細胞D(570)值與MSCs+對照腺病毒組細胞、MSCs組細胞相比均有差異(P<0.05)。在第5天,MSCs+Wnt7a腺病毒組細胞D(570)值與MSCs+對照腺病毒組細胞、MSCs組細胞相比均有差異(P<0.01)。說明,在第1、2天,MSCs感染W(wǎng)nt7a腺病

10、毒組細胞增殖速度與感染對照腺病毒組細胞、MSCs組細胞沒有明顯差異;在第3~5天,MSCs感染W(wǎng)nt7a腺病毒組細胞增殖速度與感染對照腺病毒組細胞、MSC組細胞有明顯差異。
　　5.Wnt7a腺病毒感染大鼠MSCs后,CyclinD1蛋白、細胞質(zhì)中β-catenin蛋白和細胞核中β-catenin蛋白表達與感染對照病毒的MSCs組相比分別增加2.1、1.5、1.7倍,均有顯著差異(P<0.05);感染對照病毒的MSCs與單純的MS

11、Cs相比上述蛋白的表達沒有差異(P>0.05)。
　　6.MSCs細胞向神經(jīng)元樣細胞誘導,將實驗細胞分成3組:MSCs組、MSCs+對照病毒組、MSCs+Wnt7a腺病毒組,3組細胞經(jīng)過誘導后均可見神經(jīng)元標記蛋白NSE的表達(圖8),但是3組的誘導分化率不同,單純的MSCs組細胞向神經(jīng)元樣細胞誘導率在45%左右,感染對照腺病毒MSCs細胞向神經(jīng)元樣細胞誘導率在40%左右,感染W(wǎng)nt7a腺病毒MSCs組細胞向神經(jīng)元樣細胞誘導率在67

12、%左右。感染W(wǎng)nt7a腺病毒MSCs組細胞與感染對照腺病毒MSCs細胞相比存在明顯差異(P<0.05),感染對照組腺病毒MSCs細胞與純MSCs組細胞相比沒有差異(P>0.05)。
　　結論:
　　1.通過密度梯度離心貼壁培養(yǎng)法成功的培養(yǎng)出大鼠MSCs細胞,且細胞增殖良好,此方法操作簡單;通過CD34、CD45陰性表達,CD44、CD90陽性表達和成骨誘導后堿性磷酸酶染色見鈣顆?？梢耘卸ǐ@得的細胞為MSCs。
　　2.

13、通過PCR陽性克隆鑒定、測序、Western blot及滴度鑒定實驗證明腺病毒構建成功。
　　3.對照腺病毒在MOI=80時感染效果最好,Wnt7a過表達病毒在MOI=100時感染效果最好,后續(xù)實驗按照此MOI值進行。
　　4.Wnt7a對大鼠MSCs有明顯的促進作用。
　　5.Wnt7a蛋白過表達后提高CyclinD1蛋白、細胞質(zhì)中β-catenin蛋白和細胞核中β-catenin蛋白表達,可能激活了經(jīng)典的Wnt/β