養(yǎng)殖對蝦病原性弧菌拮抗菌的篩選和效果評價.pdf

1、第一部分：人工養(yǎng)殖對蝦可培養(yǎng)細菌數(shù)量及組成分析。為深入了解人工養(yǎng)殖條件下養(yǎng)殖對蝦腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)和攜帶病毒情況，本部分應(yīng)用常規(guī)細菌分離、培養(yǎng)與純化，細菌16SrDNA序列分析的方法分析了我國山東、江蘇、韓國不同養(yǎng)殖場的凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）和中國明對蝦（Fenneorpenaeus chinensis）腸道內(nèi)可培養(yǎng)細菌的總數(shù)、優(yōu)勢菌組成和數(shù)量，并用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Nested polymerase ch

2、ain reaction，Nested PCR)方法檢測對蝦攜帶病毒情況。結(jié)果顯示各批次凡納濱對蝦和中國明對蝦對蝦樣品腸道內(nèi)的可培養(yǎng)細菌總數(shù)在105-109cfu/g之間，并對分離出的優(yōu)勢菌進行屬（種）鑒定，結(jié)果表明這些優(yōu)勢菌分別屬于乳球菌屬（Lactococcus sp.）、弧菌屬（Vibrio sp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium sp.）、希瓦氏菌屬（Shewanella sp

3、.）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）、微小桿菌屬（Microbacterium sp.）。凡納濱對蝦和中國明對蝦均有樣品檢測為WSSV陽性，6批次WSSV陽性對蝦樣品中均檢測到弧菌屬細菌，占可培養(yǎng)細菌比例為33％-93.58%。2批次 WSSV陽性對蝦樣品中檢測到希瓦氏菌屬細菌，占可培養(yǎng)細菌比例為21.67%-34.21%。4批次WSSV陽性對蝦樣品中檢測到發(fā)光桿菌屬細菌，占可培養(yǎng)細菌比例為21.03%-66.83%。

4、r>　　第二部分：抗哈維氏弧菌芽孢桿菌的篩選及其效果的研究。采用濾紙片法和共培養(yǎng)的方法篩選出4株芽孢桿菌對哈維氏弧菌有明顯拮抗作用。4株芽孢桿菌的編號分別為2012070203、2011120601、20110910012和2013103110，由本實驗室分離鑒定保存。對4株芽孢桿菌進行16SrDNA序列分析，分析相關(guān)細菌相應(yīng)序列的同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)合細菌表型特征以及16SrDNA序列分析最終鑒定結(jié)果為：2012070203為蠟

5、樣芽孢桿菌，2011120601為地衣芽孢桿菌，20110910012為短小芽孢桿菌，2013103110為巨大芽孢桿菌。將4株已鑒定的芽孢桿菌分別添加到飼料中，配制成4種實驗飼料，投喂凡納濱對蝦21d后，注射哈維氏弧菌5.98×106cfu/ml觀察14d，14d后對照組的累計死亡率為100%，蠟樣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌實驗組的累計死亡率分別為91.11%和95.55%，與對照組無顯著差異(P>0.05)。地衣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌實

6、驗組的累計死亡率分別為77.78%和84.44%，顯著低于對照組(P<0.05)。
　　第三部分：1株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）腸道菌群和非特異免疫基因表達量影響的研究。實驗對蝦和感染實驗同第二部分，其中對照組每日投喂普通商品飼料，實驗組每日投喂在普通商品飼料中添加地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）1.0×108cf

7、u/ml配制成的實驗飼料。養(yǎng)殖期間每7d取樣，分析對蝦腸道總菌數(shù)和弧菌數(shù)的變化。感染哈維氏弧菌后0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h和7d取樣，分析地衣芽孢桿菌對凡納濱對蝦溶菌酶（Lysozyme,Lzm）和Toll受體（Toll receptor）mRNA的相對表達量的影響。實驗結(jié)果表明，與對照組相比，實驗組可顯著降低對蝦腸道內(nèi)弧菌數(shù)量(P<0.05)。感染哈維氏弧菌后，實驗組溶菌酶mRNA的相對表達量在12h、

8、18h、24h、36h、48h、72h均顯著高于對照組(P<0.05)。實驗組感染哈維氏弧菌后在6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、7d的Toll受體mRNA的相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。
　　第四部分：飼料添加單一或復(fù)合益生菌對凡納濱對（Litopenaeus vannamei）抗副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytics)感染能力影響的研究。將地衣芽孢桿菌（Bacillus li

9、cheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌（1:1）添加到基礎(chǔ)飼料中，配制成的3組實驗飼，實驗飼料益生菌的終濃度為107cfu/g。投喂凡納濱對蝦21d后，注射感染副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），感染劑量為1.0×106cfu/ml，感染14d后統(tǒng)計各組的累計死亡率。14d后對照組的累計死亡率為100%，地衣芽孢桿菌實驗組的累計死亡率為73.34

10、%，枯草芽孢桿菌實驗組的累計死亡率為77.78%，地衣芽孢桿菌/枯草芽孢桿菌復(fù)合實驗組的對蝦累計死亡率為68.89%，三個實驗組的累計死亡率均顯著低于對照組(P<0.05)。實驗結(jié)果表明飼料中添加芽孢桿菌可以提高凡納濱對蝦抗副溶血弧菌感染的能力，且復(fù)合益生菌的使用效果要優(yōu)于單一益生菌。
　　第五部分：飼料添加復(fù)合益生菌對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)非特異免疫基因表達水平的影響。對蝦的養(yǎng)殖和飼料的制備同第四

11、部分，感染副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）后0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h和7d取樣，采用實時熒光定量PCR方法，對保護率最高的地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌實驗組進行凡納濱對蝦相關(guān)免疫基因表達水平的分析。實驗結(jié)果表明，感染副溶血弧菌后，地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌組凡納濱對蝦血淋巴中的IMD、penaiedin3a、proPO、LZM和Crustin的mRNA的相對表達量均顯著上調(diào)，且