pEGFP-N1-Igf1質(zhì)粒對(duì)大鼠牙囊細(xì)胞增殖及分化影響的初步研究.pdf

1、目的:構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1/Igf1，Igf1與EGFP融合表達(dá)。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-N1/Igf1轉(zhuǎn)染SD大鼠牙囊細(xì)胞，分析其對(duì)細(xì)胞增殖及分化效應(yīng)的早期影響，為Igf1基因在牙周組織工程修復(fù)與再生中的應(yīng)用提供參考。
　　 方法:1.根據(jù)SD大鼠Igf1基因在GeneBank中的序列設(shè)計(jì)引物。巢氏PCR擴(kuò)增出目的基因，與pMD-19T載體連接構(gòu)建pMD-19T/Igf1克隆載體。2.應(yīng)用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ及

2、XhoⅠ對(duì)pMD-19T/Igf1與pEGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。使用連接酶SolutionⅠ連接酶切后的Igf1片段及pEGFP-N1片段。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后進(jìn)行PCR、酶切、測(cè)序等鑒定。3.原代培養(yǎng)SD大鼠牙囊細(xì)胞，細(xì)胞傳至第四代時(shí)進(jìn)行來(lái)源鑒定。實(shí)驗(yàn)分組:①空白組、②pEGFP-N1/Igf1組、③pEGFP-N1+脂質(zhì)體組、④pEGFP-N1/Igf1+脂質(zhì)體組。4.熒光觀察:轉(zhuǎn)染后每隔24h在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的

3、表達(dá)情況，連續(xù)觀察96 h。5.細(xì)胞活力檢測(cè)（MTT法）:96孔板接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后每隔24 h檢測(cè)各組細(xì)胞活力，連續(xù)檢測(cè)8d。6.ALP定量檢測(cè)（比色法）:24孔板接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后每隔24 h收集細(xì)胞培養(yǎng)液檢測(cè)ALP含量，連續(xù)檢測(cè)6d。7.Ⅰ型膠原Col1α1及Col1α2基因表達(dá)檢測(cè)（熒光定量PCR法）:6孔板接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。以空白組為參照，計(jì)算其它處理組基因的相對(duì)表達(dá)量。
　　 結(jié)果:1.經(jīng)PCR、酶切、測(cè)

4、序等鑒定pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.綠色熒光觀察情況:轉(zhuǎn)染后48 h綠色熒光表達(dá)量最強(qiáng)。3.細(xì)胞增殖活力:轉(zhuǎn)染48 h-96 h細(xì)胞活力均為③④組＜①②組(p＜0.05)。轉(zhuǎn)染96 h時(shí):①組＜②組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在轉(zhuǎn)染48 h時(shí):③組＜④組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。4.胞外ALP活性:整體趨勢(shì):①④兩組

5、較為接近，②組ALP含量在96 h內(nèi)始終高于其它組，在72 h時(shí)達(dá)到最峰，③組ALP含量在96 h內(nèi)始終低于其它組。轉(zhuǎn)染后24 h時(shí):②組＞①組＞④組＞③組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染后48 h時(shí):②組＞④組＞①組＞③組，除①④兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.7＞0.5），其余均差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染后72 h時(shí):②組＞④組＞①組＞③組，除①④兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.908＞0.5)，其余均差異均有統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染后96 h時(shí):②組＞①組＞④組＞③組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。5.Col1α1及Col1以基因表達(dá)情況(轉(zhuǎn)染后48 h): Col1α1相對(duì)表達(dá)量:④組＞②組＞①組＞③組;Col1α2相對(duì)表達(dá)量:④組＞②組＞①組＞③組。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建Igf1基因C端融合EGFP的真核表達(dá)載體:pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒。2.脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)

7、染在轉(zhuǎn)染48 h時(shí)目的蛋白的表達(dá)最強(qiáng)。3.脂質(zhì)體Lipofectamine2000對(duì)SD大鼠牙囊細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性。pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，裸質(zhì)粒組在轉(zhuǎn)染96 h時(shí)、脂質(zhì)體組在轉(zhuǎn)染48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞的促增殖效應(yīng)最大。4.pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒可增強(qiáng)胞外ALP活性，具有一定的促SD大鼠牙囊細(xì)胞成骨向分化的作用。脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性作用降低了胞外ALP活性，脂質(zhì)體組pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒促進(jìn)ALP表達(dá)