ET-1和CGRP對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和增殖的影響.pdf

1、第一部分內(nèi)皮素-1對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和增殖的影響及機(jī)制研究研究 目的：通過ET-1作用于大鼠VSMC及對(duì)ET-1受體信號(hào)的阻斷，探討ET-1對(duì)VSMC表型轉(zhuǎn)化和增殖的影響及機(jī)制。 研究方法：體外培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC，實(shí)驗(yàn)取第4～5代細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)一，實(shí)驗(yàn)分為：A<,1>：對(duì)照組、B<,1>：ET-1組、C<,1>：ET-1+BQ123．組。用無血清DMEM培養(yǎng)液同步化處理24h后，各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物(

2、ET-1，10<'-7>mol/L：BQ123，10<'-6>mol/L)，作用48h后收集細(xì)胞，用5．BrDU標(biāo)記細(xì)胞增殖情況；RT-PCR檢測(cè)’VSMC增殖負(fù)性調(diào)控基因HRG-1和表型標(biāo)志基因SM22a的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二，實(shí)驗(yàn)分為：A<,2>：有血清培養(yǎng)72h組；B<,2>：無血清對(duì)照組；C<,2>：ET-1組；D2：ET-1+BQ123組。用無血清DMEM培養(yǎng)液同步化處理24h后，各組細(xì)胞換用含10％NCS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)

3、72h，此時(shí)A<,2>組終止培養(yǎng)收集細(xì)胞，其余各組換成無血清培養(yǎng)液并分別加入相應(yīng)藥物(ET-1，10<'-7>mol/L；BQ123，10<'-6>mol/L)作用48h，收集細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)HRG-1和SM22a mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)一：免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，ET-1作用組可見大量增殖的VSMC，而加入ET-1受體阻斷劑BQ123后標(biāo)記的增殖細(xì)胞顯著減少。RT-PCR檢測(cè)中，ET-1組HRG-1和SM22a mRNA

4、表達(dá)較對(duì)照組有明顯下調(diào)，而加入阻斷劑BQ123可拮抗這一作用。實(shí)驗(yàn)二： RT-PCR檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)BQ123有阻斷ET-1下調(diào)VSMC HRG-1和SM22a兩個(gè)基因表達(dá)的作用。 結(jié)論：1．ET-1對(duì)收縮型VSMC有明顯的促增殖作用，并可使VSMC表型從收縮型向合成型轉(zhuǎn)化；2．ET-1對(duì)合成型VSMC同樣有促表型轉(zhuǎn)化和增殖的作用，表明ET--1對(duì)VSMC的作用是一種不可逆的因素。3．受體信號(hào)途徑是ET-1促VSMC表型轉(zhuǎn)化和增殖

5、的作用機(jī)制之一。 第二部分內(nèi)皮素-1與CGRP共作用對(duì)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和增殖的影響研究 目的：通過ET-1與降鈣素基因相關(guān)肽(CGRF),共同作用于VSMC，研究CGRP抑制ET-1促VSMC表型轉(zhuǎn)化和增殖的作用及機(jī)制。研究方法：體外培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC，實(shí)驗(yàn)取第4～5代細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)一，實(shí)驗(yàn)分為： a<,1>：對(duì)照組；b<,1>：ET-1組；c<,1>: ET-1+CGRP組(ET-1作用24h后，再加C

6、GRP)；d<,1>：CGRP+ET-1組(CGRP作用24h后，再加ET-1)。無血清DMEM培養(yǎng)液同步化處理24h后，各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物(ET-110<'-7>mol/L；CGRP，2x10<'-7>mol／L)，作用48h后收集細(xì)胞，用5-BrDU標(biāo)記細(xì)胞增殖情況，RT-PCR檢測(cè)HRG-1和SM22a mRNA的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二，試驗(yàn)分為：a<,2>：血清培養(yǎng)72h組；b<,2>：無血清對(duì)照組；C<,2>： ET-1組；

7、d<,2>：ET-1+CGRP組(ET-1作用24h后，再加CGRP)；e<,2>：CGRP+ET-1組(CGRP作用24h后，再加ET-1)。無血清DMEM培養(yǎng)液同步化處理24h后，各組細(xì)胞換用含10％NCS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)72h，此時(shí)a<,2>組終止培養(yǎng)收集細(xì)胞，其余各組換成無血清培養(yǎng)液并分別加入相應(yīng)藥物(ET-1 10<'-7>mol/L；CGRP，2x 10<'-7>mol/L)作用48h，收集細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)HRG-1

8、和SM22a mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)一：免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，ET-1組有大量標(biāo)記的平滑肌增殖細(xì)胞，加入CGRP后增殖細(xì)胞稍微有所減少，而先加CGRP作用組中增殖細(xì)胞數(shù)量大大減少。RT-PCR檢測(cè)中，ET-1組較對(duì)照組VSMC HRG-1和SM22a基因表達(dá)顯著下調(diào)：加入CGRP兩基因表達(dá)有所上調(diào)，但不明顯；而現(xiàn)加CGRP作用組中兩種基因表達(dá)上調(diào)明顯。實(shí)驗(yàn)二：RT-PCR檢測(cè)進(jìn)一步證明，CGRP可阻斷ET-1下調(diào)VSMC HR