瘢痕疙瘩差異表達(dá)基因的篩選及標(biāo)志蛋白的分析.pdf

1、研究背景及目的： 瘢痕疙瘩是人類(lèi)特有的一種病理現(xiàn)象，由其產(chǎn)生的畸形和功能障礙在臨床上時(shí)常遇到，是美容、整形外科最棘手的問(wèn)題之一。瘢痕疙瘩不同于一般的瘢痕組織，具有過(guò)度生長(zhǎng)、超過(guò)原傷口界限、侵犯臨近組織呈瘤樣增生，而且有自始自終不退化，單純手術(shù)切除易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。至今瘢痕疙瘩的病因還不清楚，因此治療也沒(méi)有特別有效的方法。如何尋找并闡明瘢痕疙瘩病因，是最終徹底治愈瘢痕疙瘩唯一有效方法。關(guān)于瘢痕疙瘩的病因，人們一直在努力探究，做了大量的

2、研究。從各個(gè)方面、各個(gè)角度來(lái)闡明瘢痕疙瘩的病因，如從瘢痕疙瘩發(fā)生與傷口受到較大張力牽引，提出的力學(xué)和機(jī)械學(xué)說(shuō)；從瘢痕疙瘩處于缺血缺氧狀態(tài)提出的缺血學(xué)說(shuō)；還有免疫反應(yīng)學(xué)說(shuō)，膠原合成與降解失衡學(xué)說(shuō)，細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)、細(xì)胞凋亡異常學(xué)說(shuō)以及遺傳學(xué)說(shuō)等等，這些學(xué)說(shuō)都從一個(gè)方面說(shuō)明了瘢痕疙瘩與這些因素之間有著或多或少的聯(lián)系，但都不能完全說(shuō)明瘢痕疙瘩發(fā)生的確切病因。如何從整體考量、全面分析基因來(lái)捕捉瘢痕疙瘩致病基因，而不是主觀臆定某一基因或因子作為研究對(duì)

3、象，是尋找瘢痕疙瘩病因的關(guān)鍵所在。 人類(lèi)23對(duì)染色體大約含有10萬(wàn)個(gè)基因，其中大約只有15％表達(dá)于個(gè)體細(xì)胞?；虻倪x擇性表達(dá)決定了有機(jī)體的發(fā)育和分化等各項(xiàng)生命活動(dòng)。不僅如此，多種因素造成的基因表達(dá)改變，單基因突變或多基因協(xié)同作用，均可改變有機(jī)體的正?；顒?dòng)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。所以，比較病變組織與正常組織中基因表達(dá)的差異，對(duì)疾病的診斷和治療具有重要意義。該實(shí)驗(yàn)利用抑制消減雜交(SSH)技術(shù)，對(duì)瘢痕疙瘩與正常皮膚組織進(jìn)行差異基因篩選。正

4、是利用分子雜交的原理去除雙方共同的序列，分離出兩種組織間差異表達(dá)的基因。另外，利用蛋白指紋圖譜(SELDI)技術(shù)檢測(cè)瘢痕疙瘩差異蛋白。這些差異表達(dá)的基因及蛋白將為尋找瘢痕疙瘩發(fā)生的病因提供有力的線(xiàn)索。 方法： 1.收集瘢痕疙瘩標(biāo)本，經(jīng)臨床及病理診斷，分別取瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織，并迅速保存于液氮中。 2.利用Clontech公司的消減抑制雜交試劑盒(ClontechPCR-SelectcDNASubtract

5、ionKit)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 3.首先提取瘢痕疙瘩和正常皮膚組織總RNA，再進(jìn)一步提取其中的mRNA。 4.以提取的mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成瘢痕疙瘩和正常皮膚cDNA。瘢痕疙瘩cDNA作為實(shí)驗(yàn)方(tester)，正常皮膚cDNA作為雜交驅(qū)動(dòng)方(driver)。 5.為了使DNA分子雜交時(shí)機(jī)會(huì)均等，使大小長(zhǎng)度不一的cDAN分子片段基本相等，用RsaⅠ酶切，得到500bp左右大小cDNA片段。 6.瘢痕疙瘩cD

6、NA分成兩組，分別連接特殊設(shè)計(jì)的接頭：adaptor1和adaptor2R。 7.經(jīng)過(guò)兩次消減雜交，差異表達(dá)的基因片段兩端分別帶有adaptor1和adaptor2R。 8.再經(jīng)過(guò)兩次PCR擴(kuò)增。第一次PCR時(shí)只有模板片段兩端連接有兩個(gè)不同接頭的雙鏈cDNA才得以指數(shù)擴(kuò)增。第二次PCR實(shí)際上是巢式PCR，極大地提高了擴(kuò)增片段的特異性。 9.消減雜交后PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定。利用T載體進(jìn)行PCR產(chǎn)物的克隆，挑選出陽(yáng)

7、性克隆。進(jìn)行PCR鑒定，證實(shí)克隆T載體中攜帶了目的基因片段。 10.Southern雜交驗(yàn)證篩選出的差異基因。 11.挑選Southern雜交陽(yáng)性的克隆送基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GeneBank做對(duì)比，分析所得基因的結(jié)構(gòu)、功能等相關(guān)信息。 12.利用蛋白指紋技術(shù)(SELDI)，初步分析瘢痕疙瘩差異表達(dá)的蛋白。 結(jié)果： 1.瘢痕疙瘩和正常皮膚組織總RNA，于1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，顯示28S條帶比1

8、8S條帶亮2倍以上，說(shuō)明提取的總RNA質(zhì)量好，沒(méi)有降解。 2.瘢痕疙瘩和正常皮膚mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈和第二鏈合成雙鏈cDNA，經(jīng)RsaⅠ酶切，結(jié)果顯示酶切后片段大小分布在0.2～1.5kb之間，明顯比未經(jīng)酶切的對(duì)照短，說(shuō)明酶切較完全。 3.利用PCR的方法分析接頭的連接效率?？梢钥吹娇醇一騁3PDH的3’引物和PCR引物1的產(chǎn)物，同基因G3PDH特異性引物(G3PDH的3’和5’引物)所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物強(qiáng)度比

9、值高于1：4，說(shuō)明接頭連接效率至少達(dá)到25％，可用于消減雜交。 4.第1次PCR后，在消減后的樣品中呈現(xiàn)200～750bp左右的彌散帶，未見(jiàn)明顯的的特異性擴(kuò)增帶。而在未消減的樣品中可見(jiàn)范圍更寬的彌散帶，也未見(jiàn)明顯的特異擴(kuò)增帶。利用巢式引物進(jìn)行的第2次PCR擴(kuò)增后，在消減后的樣品中可見(jiàn)明顯特異擴(kuò)增的條帶，而未消減的樣品沒(méi)有出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶。試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增條帶進(jìn)一步明顯，與說(shuō)明書(shū)中的描述一致。兩次PCR擴(kuò)增非常成功。

10、 5.消減雜交得到的PCR產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂平板得到克隆菌落。隨機(jī)挑取克隆做PCR檢測(cè)，其中克隆陽(yáng)性率85％。大部分陽(yáng)性克隆PCR擴(kuò)增片段大小范圍在250～750bp內(nèi)，主要集中在500bp左右。這個(gè)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)預(yù)計(jì)的克隆片段在500bp左右相符合。 6.進(jìn)一步的Southern雜交顯示有20個(gè)差異表達(dá)基因。這些基因經(jīng)測(cè)序，序列與GeneBank做比對(duì)，分析基因結(jié)構(gòu)和功能。初步篩選出了20個(gè)在瘢痕疙瘩中表

11、達(dá)高于在正常皮膚中表達(dá)的基因片斷。經(jīng)過(guò)核苷酸序列測(cè)定及同源性分析，11個(gè)與已知功能的基因高度同源，9個(gè)為未知功能基因。在已知功能基因的片段中有與DAN轉(zhuǎn)錄、翻譯有關(guān)的基因如BTAF1基因、E4TF1基因等；有與細(xì)胞增殖、遷徙有關(guān)的基因如EPHB2基因、PDGFR基因等；有與腫瘤發(fā)生有關(guān)的基因如GAGE-7B基因等。 8.利用蛋白指紋技術(shù)(SELDI)，發(fā)現(xiàn)數(shù)種瘢痕疙瘩差異表達(dá)的蛋白。 結(jié)論： 1.利用消減抑制雜交