嗜線蟲致病桿菌幾丁質酶基因原核表達及生物活性研究.pdf

1、嗜線蟲致病桿菌Xenorhabdus nematophila HB310(Xn HB310)屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，與小卷蛾斯氏線蟲（Steinernema carpocapsae）HB310共生。前期研究發(fā)現Xn HB310具有廣譜的殺蟲和抑菌活性，該菌在離體培養(yǎng)過程中能產生多種殺蟲毒素和抑菌活性物質，其中包括幾丁質酶。為了明確共生菌中幾丁質酶的特性和功能，本研究根據GenBank中已知基因chi60（登

2、錄號:KC701470）和chi70（登錄號:KC701471）序列，設計引物克隆獲得目的基因并進行原核表達，并對表達重組蛋白的生物活性進行了研究?，F將主要結果總結如下:
　　1、構建chi60基因和chi70基因的原核表達載體pET-28a-chi60和pET-28a-chi70。將其轉入到表達感受態(tài)Escherichia coli Transetta(DE3)中，成功表達出重組蛋白Chi60和Chi70。對原核表達的誘導條件進

3、行優(yōu)化，chi60在37℃、30℃、28℃、25℃和16℃條件下的表達產物都以包涵體沉淀的形式存在，IPTG濃度為0.5mM時，包涵體表達量最高;chi70在誘導溫度為28℃、IPTG濃度為0.5mM時，可以表達出大量的可溶性重組蛋白。
　　2、利用DNS法對重組蛋白Chi60和Chi70活性進行檢測，結果表明，在42℃，重組蛋白Chi60和Chi70的外切幾丁質酶活性分別為0.71U/mL和1.59U/mL，內切幾丁質酶活性為分

4、別29.66U/mL和44.93U/mL，表明這兩種幾丁質酶都是內切幾丁質酶。重組幾丁質酶Chi60和Chi70的最適溫度和最適pH值分別為50℃和6.0。
　　3、測定了重組蛋白Chi60和Chi70對Bt HD-73的增效作用。結果表明重組幾丁質酶Chi60的復性產物沒有增效作用，重組蛋白Chi70與Bt HD-73的混合制劑對棉鈴蟲2齡幼蟲的LC50顯著高于單獨使用Bt HD-73，具有增效作用。
　　4、抑菌活性的測