鱗癌細(xì)胞的hB7-H3基因轉(zhuǎn)染及其檢測(cè).pdf

1、目的： B7-H3作為B7家族的最新成員，其受體在活化的T細(xì)胞表面可被誘導(dǎo)表達(dá)，B7-H3對(duì)CD4<'+>和CD8<'+>細(xì)胞的生成均具有增加作用，并可選擇性的增加IFN-γ的生成。為將B7-H3基因轉(zhuǎn)染入口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113中制備瘤苗，我們克隆人共刺激分子B7-H3基因，構(gòu)建其真核表達(dá)載體(pEGFP-C1-B7-H3)，把pEGFP-C1-B7-H3轉(zhuǎn)染到口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞中，并檢測(cè)B7-H3基因在轉(zhuǎn)染鱗癌細(xì)胞

2、Tca8113中的表達(dá)。 方法： 采用無(wú)菌肝素抗凝新鮮健康人全血，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液梯度密度離心分離淋巴細(xì)胞，在含IFN-γ1×106U/L、10％小牛血清的RPMI-1640中培養(yǎng)1d，然后用Trizol提取總 RNA。用RT-PCR方法將B7-H3的編碼序列cDNA擴(kuò)增。然后將該基因的編碼序列插入到真核熒光蛋白載體pEGFP-C1中，構(gòu)建成最終的真核表達(dá)載體pEGFP-C1-B7-H3。運(yùn)用脂質(zhì)體方法將pEGFP-C1

3、-B7-H3轉(zhuǎn)染到口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113中，轉(zhuǎn)染24h、36h、48h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，待轉(zhuǎn)染成功后，用 RT-PCR檢測(cè)基因B7-H3在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)；用Western blot檢測(cè)其蛋白的表達(dá)。以絲裂霉素C(MMC)處理后，用有限稀釋法建立穩(wěn)定高表達(dá)的帶有B7-H3基因的Tca8113鱗癌細(xì)胞株。 結(jié)果： 從人淋巴細(xì)胞中提取RNA A260/A280的比值為1.8，通過(guò)凝膠電泳鑒定，證實(shí)R

4、NA的完整性符合RT-PCR要求。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果表明，B7-H3的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約951kb，與預(yù)計(jì)B7-H3cDNA的大小一致。挑取酶切陽(yáng)性的克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定，應(yīng)用Blast軟件與GenBank中人B7-H3序列進(jìn)行同源性比較，同源性為100％。經(jīng)Bsp119I和XhoI雙酶切對(duì)EGFP-C1-B7-H3重組質(zhì)粒酶切鑒定表明，pEGFP-C1-B7-H3在凝膠電泳上顯示兩片段分別約1.0kb和4kb。證明重組質(zhì)粒

5、pEGFP-C1中已經(jīng)克隆入B7-H3目的基因。用Trizol從轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-B7-H3了的Tca8113細(xì)胞中提取總RNA，然后用RT-PCR檢測(cè)B7-H3的表達(dá)。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約215bp，與預(yù)期的大小一致。轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1的Tca8113細(xì)胞中，沒(méi)有檢測(cè)到215bp的PCR產(chǎn)物。用Westernblot方法抽提B7-H3/Tca8113基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，DAB顯色，裂解已轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-

6、B7-H3的Tea8113細(xì)胞(B7-H3/Tca8113)的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞膜蛋白中相對(duì)分子質(zhì)量約65～86KD大小的特異性條帶；而mock/Tca811沒(méi)有特異性條帶。用脂質(zhì)體2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒把pEGFP-C1-B7-H3載體轉(zhuǎn)入口腔鱗癌細(xì)胞株Tca8113中，24h、36h、48h左右在10×20倍倒置顯微鏡下用熒光觀察細(xì)胞(光波波長(zhǎng)488nm或513nm)，同時(shí)與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113做對(duì)照。轉(zhuǎn)染B7-H3的T

7、ca8113細(xì)胞，經(jīng)過(guò)細(xì)胞傳代培養(yǎng)后仍然能夠檢測(cè)到高表達(dá)的B7-H3基因，經(jīng)過(guò)有限稀釋法建立了B7-H3/Tca8113細(xì)胞株。 結(jié)論： 酶切及RT-PCR證實(shí)成功構(gòu)建人B7-H3的真核表達(dá)載體pEGFP-C1-B7-H3，用脂質(zhì)體法把該載體轉(zhuǎn)染到口腔鱗癌細(xì)胞Tea8113中，用RT-PCR及Western blot鑒定B7-H3基因在該細(xì)胞中有表達(dá)。用有限稀釋法建立了B7-H3/Tca8113細(xì)胞株，為以后的體內(nèi)外試驗(yàn)