應(yīng)用基因芯片篩選胃癌和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及生物信息學(xué)研究.pdf

1、研究背景:胃癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在我國(guó)其死亡率居惡性腫瘤首位.進(jìn)展期胃癌的預(yù)后很差,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后差和導(dǎo)致患者死亡的根本原因.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的甲.期事件,也是胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素,因此研究淋巴道轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于臨床腫瘤患者的診治具有十分重要的意義.腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移受多種因素調(diào)控,是多種生物分子和信號(hào)通路相互作用的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程.傳統(tǒng)的研究方法一次只能檢測(cè)一個(gè)或幾個(gè)基因,很難詮釋腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的全部過(guò)程.DNA微

2、陣列是最有效的檢測(cè)腫瘤基因差異表達(dá)譜的技術(shù)之一,它對(duì)于探討胃癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,尋找胃癌早期診斷、判斷預(yù)后的分子標(biāo)記物和臨床治療靶點(diǎn)具有非常重要的意義. 研究目的：本研究采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)比較正常胃粘膜(非腫瘤組織)、胃癌原發(fā)灶和胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的基因表達(dá)譜,旨在篩選與胃癌發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因,為進(jìn)一步闡明胃癌發(fā)生和淋巴道轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制、評(píng)估胃癌病人預(yù)后和實(shí)施個(gè)體化治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ). 方法：應(yīng)用TRI

3、zol法分別提取正常胃粘膜(A組)、胃癌原發(fā)灶(B組)和胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶(C組)組織的總RNA,用HPLC純化T7-(d7)24 primer反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,經(jīng)Phase Lock Gel fPLG)一酚氯仿純化后,以三種組織的cDNA為模板,應(yīng)用Affymetrix公司的BioArray High Yield RNA Transcript Labelingkit進(jìn)行體外反轉(zhuǎn)錄,同時(shí)進(jìn)行生物素標(biāo)記,合成生物素化的cRNA探針.合

4、成好的cRNA探針質(zhì)控合格后經(jīng)片段化處理(大小約50-200bp之間),分別在Affymetrix公司的專用設(shè)備Affymetrix<○R>Ftybridization Oven 640中與Affymetrix Genechip HG-U133A2.0(包括22,277個(gè)轉(zhuǎn)錄本,對(duì)應(yīng)于約20,247個(gè)人已知基因和1475個(gè)EST)雜交16小時(shí),雜交后的芯片經(jīng)過(guò)洗脫、染色處理,使用Affymetrix<○R>Scanner3000 7G對(duì)

5、雜交信號(hào)進(jìn)行掃描,芯片掃描后獲得的數(shù)據(jù)利用Affymetrix<○R>GCOS software進(jìn)行計(jì)算處理.在比較兩組芯片的結(jié)果之前,先對(duì)每張芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理.以Signal Log Ratio≥1.0或≤-1.0(表明轉(zhuǎn)錄木的水平至少提高或降低2倍)和Change p-value(代表了兩張不同芯片之間一個(gè)探針對(duì)表達(dá)水平相同或不同的可能性)≤0.05(表明比較的結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)作為篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn),并用生物信息學(xué)對(duì)檢

6、測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析.為確保芯片檢測(cè)質(zhì)量,Affymetrix基因芯片內(nèi)還設(shè)有GAPDH等看家基因作為對(duì)照,以及BIOB,BIOC、.BIOD和CRE等外加的陽(yáng)性對(duì)照以檢測(cè)基因芯片的質(zhì)量.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time-PCR)定量檢測(cè)6個(gè)已知基因(COLlA2,SPPl,PTGDS,RAC2,TFFl,CXCR4)在三種組織的表達(dá)情況,以驗(yàn)證基因芯片的檢測(cè)結(jié)果. 結(jié)果：基因芯片檢測(cè)報(bào)告表明,這三張芯片的背景值和噪音值都很

7、均勻,其中看家基因GAPDH的5＇端和3＇端的信號(hào)比值分別是1.26,1.05,1.17,均顯著低于3.0的標(biāo)準(zhǔn)值;外加的陽(yáng)性對(duì)照BIOB、BIOC、BIOD和CRE也被檢測(cè)到,并且信號(hào)強(qiáng)度隨著濃度由低到高呈現(xiàn)由弱到強(qiáng)的趨勢(shì),表明芯片質(zhì)量良好,雜交及檢測(cè)體系正常,芯片檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可信.在總共22,277個(gè)轉(zhuǎn)錄本中,A組檢測(cè)到10,930個(gè),占總轉(zhuǎn)錄本的49.1﹪:B組檢測(cè)到12353個(gè),占總轉(zhuǎn)錄本的.55.50﹪;C組檢測(cè)到11825個(gè)

8、,占總轉(zhuǎn)錄本的53.1﹪.進(jìn)一步利用Affymetrix公司的GCOS分析軟件對(duì)三組樣品的芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析,并根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)B組(原發(fā)灶)同A組(正常胃粘膜)相比,B組表達(dá)上調(diào)轉(zhuǎn)錄本1052個(gè),其中已知基因轉(zhuǎn)錄本761個(gè),EST、291,表達(dá)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本1301個(gè),其中已知基因轉(zhuǎn)錄本810個(gè),EST、491個(gè);C組同B組比較,表達(dá)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本1708個(gè),其中已知基因轉(zhuǎn)錄本1005個(gè),EST703個(gè).本文只列出

9、了各組差異表達(dá)基因最顯著的前60個(gè)基因.根據(jù)GO(Gene Ontology)分類和聚類分析,按照其參與的生物學(xué)過(guò)程(Biological Process)和分子功能(Molecular Function)進(jìn)行了初步的功能分類.在這些差異基因中,胃癌原發(fā)灶上調(diào)基因的功能主要集中在細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞移動(dòng)和粘附以及腫瘤基質(zhì)重塑與降解等方面,卜調(diào)基因的功能主要集中在胃腸道對(duì)外源性生物的代謝、正常的消化功能、免疫防御、細(xì)胞粘附(粘蛋白

10、為主)等方面;胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶上調(diào)基因的功能主要集中在細(xì)胞粘附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成與分解、細(xì)胞趨化和移動(dòng)以及細(xì)胞周期等方面;下調(diào)的基因功能主要集中在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、質(zhì)白質(zhì)等大分子代謝、細(xì)胞粘附、免疫反應(yīng)與防御等方面,反映了胃正常代謝、消化功能減退,防御保護(hù)功能削弱.同時(shí)我們通過(guò)生物信息學(xué)相關(guān)分析軟件(隊(duì)列試驗(yàn)的基因表達(dá)譜分析、基于Gene Omology分類的集群分析和Pathway分析)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘,結(jié)果顯示A、B、C組連續(xù)下調(diào)的基

11、因表達(dá)的主要趨勢(shì)(具有顯著性,P小于0.05)集中于糖類(包括多糖)代謝、上皮組織發(fā)育、以及細(xì)胞粘附等方面.A、B、C組連續(xù)上調(diào)的基因表達(dá)變化趨勢(shì)(具有顯著性,P小于0.05)集中\(zhòng)于免疫反應(yīng)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞周期及調(diào)亡相關(guān)基因.通過(guò)Pathway分析發(fā)現(xiàn),整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附信號(hào)通路中的THBSl、TLN、CAPN9、ITGAX和TGF信號(hào)通路中ENG、INHBA、Smad6和STAT1等基因在A、B、C三組呈梯度改變,提示這

12、些基因在胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起著重要作用. 結(jié)論： 1.利用基因芯片篩選胃癌及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因是一個(gè)高效、快速的方法. 2.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胃癌組織呈高增殖狀態(tài)、粘附和移動(dòng)活躍、細(xì)胞周期和細(xì)胞粘附信號(hào)通路可能異常激活;間質(zhì)呈高反應(yīng)狀態(tài),細(xì)胞外基質(zhì)重塑和降解活躍;而胃正常的生物性代謝、消化功能紊亂,胃粘膜保護(hù)抗御功能被削弱. 3.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶上調(diào)的基因主要集中在免疫反應(yīng)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因,