A39S突變型DJ-1蛋白對基因表達譜的影響及DJ-1基因突變檢測和血清DJ-1蛋白檢測分析.pdf

1、第一部分 A39S突變型DJ-1蛋白對基因表達譜的影響 背景： DJ-1基因是AREP的致病基因之一，所編碼的DJ-1蛋白是個多功能蛋白質(zhì)，涉及細胞周期調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)、雄激素受體通路信號轉(zhuǎn)導、腫瘤生成、氧化應激和線粒體功能等多個方面。它能通過調(diào)節(jié)PSF、TH、AR、Nrf2、p53等基因的轉(zhuǎn)錄活性參與多巴胺合成、氧化應激及凋亡等PD相關(guān)的病理生理過程。然而，DJ-1突變在PD發(fā)病中的具體機制尚不完

2、全清楚。傳統(tǒng)的研究方法僅局限于研究某個或某幾個可能與DJ-1蛋白存在相互作用的蛋白（或基因）及其之間簡單的調(diào)控關(guān)系，而無法全面認識在PD發(fā)生、發(fā)展過程中所有與DJ-1相關(guān)的蛋白（或基因）及其相互之間的調(diào)控關(guān)系?；蛐酒褪轻槍@種需要而發(fā)展起來的一種分子生物學新技術(shù)。 目的： 應用基因芯片技術(shù)探討DJ-1基因致病突變A39S能否通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的變化導致相關(guān)基因表達異常而參與PD的發(fā)病。 方法： 分別構(gòu)建

3、穩(wěn)定表達pCMV-Tag2A空載體、pCMV-Tag2A-DJ-1和pCMV-Tag2A-DJ-1-A39S的HEK293單克隆細胞株；應用基因表達微珠芯片對穩(wěn)定表達空載體、野生型DJ-1蛋白、A39S突變型DJ-1蛋白的HEK293單克隆細胞株進行差異表達基因篩選。 結(jié)果： 與空載體組比較，野生型DJ-1組有14個基因表達上調(diào)，28個基因表達下調(diào)；A39S突變型DJ-1組有6個基因表達上調(diào)，2個基因表達下調(diào)。A39S突

4、變型DJ-1組與野生型DJ-1組比較發(fā)現(xiàn)UGT287基因表達下調(diào)。進一步分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達基因分別參與了信號轉(zhuǎn)導、細胞粘附、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞周期、蛋白修飾、細胞凋亡、氧化應激、代謝等生物學過程，提示A39S突變型DJ-1蛋白可能通過直接或間接方式對這些基因進行表達調(diào)控，進而影響這些通路的正常功能，參與PD的發(fā)病。 結(jié)論： DJ-1基因的A39S突變能改變DJ-1蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。 第二部分應用實時熒光定量P

5、CR技術(shù)結(jié)合DNA直接測序技術(shù)檢測早發(fā)性帕金森綜合征患者DJ-1基因突變 背景： 早發(fā)性帕金森綜合征（early-onset parkinsonism，EOP）是發(fā)病年齡較早（一般≤50歲）的具有帕金森特征的一組綜合征。EOP除具有帕金森病一般特征外，還可伴有晨輕暮重，休息后減輕，肌張力障礙，多巴胺治療早期出現(xiàn)運動障礙，腱反射亢進等表現(xiàn)。從遺傳方式上看，EOP多呈隱性遺傳。目前研究表明，Parkin、DJ-1、PINK1

6、、ATP13A2等基因突變與EOP發(fā)病有關(guān)。 DJ-1基因是EOP的致病基因之一，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了包括基因外顯子缺失在內(nèi)的20余種DJ-1基因的致病突變，但其突變頻率較低，在EOP中可能僅占1％～2％或是更低。外顯子重排突變可能以雜合的形式存在，PCR擴增時這些有重排突變的外顯子仍可擴增成片段大小正常的產(chǎn)物，因此用DNA測序等非定量PCR方法不能檢測出。為了全面檢測DJ-1基因突變，國內(nèi)外普遍應用定量PCR技術(shù)結(jié)合DNA測序技術(shù)

7、進行DJ-1基因的突變檢測。 目的： 探討中國散發(fā)EOP患者DJ-1基因的突變頻率及臨床特點。 方法： 采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測DJ-1基因外顯子重排突變，結(jié)合DNA直接測序技術(shù)檢測DJ-1基因點突變、小片段插入或/和缺失突變。 結(jié)果： 應用實時熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合DNA直接測序技術(shù)對160例散發(fā)EOP患者進行DJ-1基因突變檢測，發(fā)現(xiàn)4例EOP患者存在DJ-1基因外顯子2的雜合缺

8、失突變，突變頻率為2.5％；發(fā)現(xiàn)4個已知多態(tài)IVS4+30T→G、IVS4+45 G→A、IVS4+46 G→A、IVS5+31G→A和一個新的多態(tài)IVS6+52C→T。未發(fā)現(xiàn)DJ-1特異性臨床特點。 結(jié)論： 1.應用實時熒光定量PCR技術(shù)在中國散發(fā)EOP患者中發(fā)現(xiàn)1個新的DJ-1基因致病突變：2號外顯子雜合缺失突變； 2.發(fā)現(xiàn)DJ-1基因2號外顯子重排突變的突變頻率為2.5％，提示DJ-1基因外顯子重排突變對中

9、國散發(fā)性EOP的發(fā)病可能具有重要意義； 3.應用DNA直接測序技術(shù)在中國散發(fā)EOP患者中檢測出4個已知的DJ-1基因單核甘酸多態(tài)和1個新的DJ-1基因單核甘酸多態(tài)（IVS6+52C→T）。 第三部分血清DJ-1蛋白濃度與PD相關(guān)性研究 背景： 帕金森?。≒arkinson's disease，PD）的主要病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性變性壞死和路易小體形成，然而，PD的病理改變遠早于臨床癥狀的出現(xiàn)

10、，且由于目前PD的早期診斷主要依賴于臨床癥狀，從而與原發(fā)性震顫、帕金森疊加綜合征、多系統(tǒng)萎縮、進行性核上性麻痹及皮質(zhì)基底節(jié)變性等具有相似臨床癥狀的一些疾病很難鑒別。并且，在PD的診斷確立以后，仍存在對疾病的嚴重程度及進展速度的判定問題。此外，對于神經(jīng)保護藥物的應用是否能延緩疾病的進程以及延緩的速率都需要更直接、可靠的標準來進行評判。所有這些需求都引起了研究者對于PD的生物標記的興趣。目前對于PD而言，生物標記的應用主要針對以下三方面：一

11、、對PD作出早期、正確的診斷；二、對PD嚴重程度及疾病進展速度進行評估；三、評價藥物的療效。 DJ-1蛋白在全身廣泛分布，并能在腦脊液及血漿、血清中被檢出。已有研究表明腦脊液或血漿、血清DJ-1蛋白濃度可能作為某些腫瘤、腦血管疾病及神經(jīng)變性疾病診斷及病程判斷的生物標記。 目的： 檢測DJ-1蛋白在中國人群散發(fā)性PD患者血清中的表達水平，明確血清DJ-1蛋白濃度是否可作為PD診斷及病程判斷的生物標記。 方

12、法： 應用ELISA技術(shù)對120名散發(fā)PD患者及126名性別、年齡匹配的正常對照進行血清DJ-1蛋白濃度的測定；應用統(tǒng)計學方法對兩組測定值進行比較分析。 結(jié)果： PD組（未分期）與對照組血清DJ-1蛋白濃度比較差異無統(tǒng)計學意義（p=0.113）；PD組（Hoehn-Yahr分期）與對照組血清DJ-1蛋白濃度比較差異無統(tǒng)計學意義（p=0.441）；PD組不同病程與對照組血清DJ-1蛋白濃度比較差異無統(tǒng)計學意義（p