脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白43參與慢性神經(jīng)痛調(diào)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分慢性神經(jīng)痛大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白43的表達(dá) 目的:通過(guò)坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷(CCI)模型研究慢性神經(jīng)痛大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)表達(dá)的變化。 方法:3～4周齡SD大鼠38只隨機(jī)分配到兩組，分別接受右坐骨神經(jīng)結(jié)扎手術(shù)(CCI組)和假手術(shù)(Sham組，暴露分離坐骨神經(jīng)，但未行結(jié)扎)。手術(shù)前1d以及手術(shù)后1d，3d，5d，7d，14d(分別記為d0、d1、d3、d5

2、、d7、d14)，觀察大鼠疼痛行為學(xué)變化并測(cè)定后肢熱刺激回縮潛伏期(PWTL)、電刺激回縮閾值(PWET)的變化；于d14取大鼠L45右側(cè)脊髓采用免疫組化分析Cx43和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidprotein，GFAP)表達(dá)的變化，并以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參照基因，采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)半定量分析CCI組和Sham組大鼠L4-5脊髓Cx43、GFAPmRNA表達(dá)的差異。

3、 結(jié)果:手術(shù)后第7天，Sham組大鼠行走步態(tài)恢復(fù)正常，而CCI組大鼠術(shù)后一直表現(xiàn)為跛行、不能負(fù)重等行走步態(tài)異常。與d0比較，CCI組術(shù)后右后肢PWTL、PWET明顯降低(P＜0.01)，Sham組d1、d3、d5輕度降低，d7后恢復(fù)至術(shù)前基礎(chǔ)水平(P＞0.05)；組間同時(shí)點(diǎn)比較CCI組降低程度明顯大于Sham組。觀察期內(nèi)，兩組大鼠手術(shù)前后左后肢PWTL、PWET無(wú)明顯改變。術(shù)后d14免疫組化顯示CCI組脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞與Sham組

4、相比呈現(xiàn)為明顯活化狀態(tài)，胞體大，突起多而粗大。CCI組和Sham組L4-5脊髓右側(cè)背角GFAP陽(yáng)性染色面積分別占(29±7)％和(19±5)％(P＜0.01)；Cx43陽(yáng)性染色面積分別占(17±3)％和(4±1)％(P＜0.01)；CCI組陽(yáng)性染色增多主要集中在脊髓Ⅰ～Ⅲ層。Sham組脊髓L4-5Cx43擴(kuò)增產(chǎn)物量極少，而CCI組Cx43擴(kuò)增產(chǎn)物量約為Sham組3.0倍；CCI組GFAP擴(kuò)增產(chǎn)物量約為Sham組的1.35倍。 結(jié)

5、論:慢性神經(jīng)痛大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43蛋白及mRNA表達(dá)增加，其中脊髓背角淺層Cx43蛋白表達(dá)增加最為顯著，且Cx43與GFAP表達(dá)變化相一致，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接可能在神經(jīng)痛的形成和維持中起重要作用。 第二部分鞘內(nèi)注射MK-801對(duì)慢性神經(jīng)痛大鼠的治療作用及對(duì)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43表達(dá)的影響 目的:觀察鞘內(nèi)注射NMDA受體拮抗劑MK-801對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷(CCI)慢性神經(jīng)痛的治療效應(yīng)，并觀察其對(duì)脊

6、髓星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)表達(dá)的影響。 方法:3周齡SD雄性大鼠24只隨機(jī)分為3組(n=8)，分別為組Ⅰ：假手術(shù)(分離暴露坐骨神經(jīng)，不行坐骨神經(jīng)結(jié)扎)大鼠，鞘內(nèi)注射生理鹽水(NS)；組Ⅱ：CCI慢性疼痛模型大鼠，鞘內(nèi)注射MK-801(10μg)；組Ⅲ：CCI慢性疼痛模型大鼠，鞘內(nèi)注射NS。從坐骨神經(jīng)結(jié)扎手術(shù)(或假手術(shù))當(dāng)天開(kāi)始，連續(xù)15天，每24h鞘內(nèi)注射MK-801或NS一次。手術(shù)前以及手

7、術(shù)后第7d、14d測(cè)定后肢熱刺激回縮潛伏期(PWTL)、電刺激回縮閾值(PWET)的變化；于第14d取大鼠L4-5右側(cè)脊髓采用RT-PCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)Cx43蛋白和mRNA表達(dá)，比較組間差異。 結(jié)果:三組大鼠基礎(chǔ)痛閾無(wú)顯著差異。組Ⅰ大鼠各觀測(cè)時(shí)點(diǎn)PWTL、PWET無(wú)顯著差異(P＞0.05)。組Ⅲ大鼠接受CCI術(shù)后第7d、14d都表現(xiàn)有右后肢PWTL、PWET明顯降低(P＜0.01)，左后肢無(wú)明顯變化。組Ⅱ大鼠CCI術(shù)后7d

8、、14d左后肢PWTL、PWET有輕度升高；右后肢PWTL、PWET有顯著降低，但明顯高于組Ⅲ同時(shí)點(diǎn)痛閾(P＜0.01)。RT-PCR顯示組ⅢCx43基因表達(dá)量分別為組Ⅱ的1.9倍，組Ⅰ的3.8倍。免疫印跡顯示組Ⅰ、組Ⅱ和組ⅢL4/5右側(cè)脊髓Cx43蛋白表達(dá)量分別為(8.4±2.5)、(17.1±4.0)和(3.9±5.2)。 結(jié)論:MK-801在有效防治CCI模型大鼠痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象的同時(shí)，大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43表達(dá)量也顯著

9、下降。 第三部分縫隙連接阻斷劑對(duì)大鼠慢性神經(jīng)痛治療作用的研究 目的:觀察鞘內(nèi)注射縫隙連接阻斷劑甘珀酸(CBX)對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷(CCI)慢性神經(jīng)痛的治療作用及對(duì)脊髓原癌基因c-fos表達(dá)的影響。 方法:60只3周齡SD大鼠參照文獻(xiàn)方法行32G聚氨酯鞘內(nèi)導(dǎo)管并創(chuàng)建CCI慢性神經(jīng)痛模型。右坐骨神經(jīng)結(jié)扎前和結(jié)扎后第7d測(cè)定后肢熱刺激回縮潛伏期(PWTL)、電刺激回縮閾值(pWET)的變化。CCI術(shù)后第8

10、d，所有大鼠隨機(jī)分為C0、C1、C5、C25、C100等5組(n=12)，分別鞘注CBX0μg，1μg，5μg，25μg，100μg。鞘內(nèi)注射CBX0.5h、1h、2h、3h、4h、24h后測(cè)定大鼠后肢的PWTL和PWET。鞘內(nèi)注射CBX1h后每組大鼠各取6例，采用RT-PCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)L4-5右側(cè)脊髓c-fos表達(dá)。LSD法比較組間c-fos表達(dá)差異。 結(jié)果:各組大鼠CCI術(shù)后第7d右后肢PWTL、PWET均比術(shù)前顯著

11、降低(P＜0.01)。鞘注CBX后，C0、C1、C5、C25組左后肢PWTL、PWET無(wú)明顯改變，C100組左后肢PWTL、PWET有所升高(p＜0.05)。鞘注CBX后，C1、C5、C25、C100組右后肢均表現(xiàn)有痛閾升高，PWTL、PWET呈劑量依賴性延長(zhǎng)。此痛閾升高效應(yīng)在鞘注CBX后0.5h作用最明顯，3h后作用基本消失。RT-PCR顯示鞘注不同劑量CBX后，各組大鼠右側(cè)L4-5脊髓c-fosmRNA表達(dá)量以β-actin為參照分