雞TAP1基因多態(tài)性及其在先天免疫中mRNA表達規(guī)律研究.pdf

1、我國是養(yǎng)禽大國且產業(yè)發(fā)展迅速，而疾病是限制養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個重要因素。長期以來，疾病的控制主要依賴疫苗，由于病原微生物的變異及毒力的不斷增強等原因，使得疫苗使用效果不斷下降。因此，研究者開始轉向抗病育種研究，期望能從遺傳上提高家禽的抗病能力。研究表明，在家禽中MHC(major histocompatibility complex，主要組織相容性復合體)基因與多種疾病的抗性存在高度相關性，是家禽抗病育種研究中的優(yōu)選標記基因。在雞上，位于M

2、HC基因核心位置的TAP1基因(Transporter associated antigen processing，抗原處理相關轉運體)，是編碼一類在內源性抗原的呈遞過程中起著重要作用的轉運蛋白的基因，與抗病性、先天免疫應答及經濟性狀間具有相關性。本研究以29個中國地方雞種和國外雞種為研究對象，研究不同雞種TAP1基因多態(tài)性，對這些雞種進行單倍型判定;并對廣西黃雞感染腸炎沙門氏菌后的TAP1表達量變化及不同單倍型個體TAP1表達規(guī)律進行

3、研究，主要結果如下:
　　1.為了研究TAP1基因的多態(tài)性，本研究選取國內外29個雞種，每個雞種以10個個體的DNA混池對TAP1基因進行目標捕獲測序，測序結果與NCBI中參考序列(登錄號:427727)比較后發(fā)現(xiàn):在TAP1基因外顯子上，青腳麻雞是存在SNP最多的品種，文昌雞只存在1個SNP，而如皋黃雞，雪山雞和太湖雞不存在SNP。同時，研究發(fā)現(xiàn)國外雞種，如羅斯雞，隱性白羽雞，安卡雞和AA雞的TAP1基因SNP突變數(shù)量較地方雞種

4、少;國外品種的INDEL突變也相對較少。在TAP1基因內含子上，烏骨雞、SPF雞、雪山雞、藏雞和雜交雞所含SNP數(shù)量較多，廣西黃雞和綠殼蛋雞所含INDEL數(shù)量較多;國內外品種比較發(fā)現(xiàn)，國外雞種所含突變數(shù)量亦較國內地方品種少。在TAP1基因啟動子上，在斗雞、固始雞、蕭山雞、鹿苑雞和斗雞雜交品種在67309位置存在10 bp的缺失，而綠殼蛋雞在此出現(xiàn)了20 bp缺失，出現(xiàn)缺失突變的均為國內地方品種。以上結果表明我國地方雞種TAP1基因在外顯

5、子和啟動子區(qū)具有豐富的遺傳多樣性，TAP1基因可作為先天免疫研究的候選基因。
　　2.根據(jù)TAP1基因啟動子多態(tài)性重點對廣西黃雞進行不同單倍型篩選，結果發(fā)現(xiàn)TAP1基因啟動子同樣存在1個10 bp的缺失，廣西黃雞中存在AA、AB和BB3種基因型;野生等位基因（與參考序列中紅色原雞一致）與突變等位基因頻率分別為0.847、0.153，PIC為0.239，平均雜合度為0.278，經卡方適合性檢驗，廣西黃雞群體中TAP1基因處于Hard

6、y-Weinberg平衡狀態(tài)。經JASPAR數(shù)據(jù)庫預測，TAP1基因啟動子10bp缺失區(qū)域可能存在3個轉錄因子結合位點。
　　3.1日齡廣西黃雞感染腸炎沙門氏菌后0-21 dpi(day-po st-infection)盲腸載菌量結果表明，攻毒組沙門氏菌載菌量5d最高，2h到5d載菌量逐漸升高，5d到21d逐漸降低。血漿中細胞因子水平變化結果表明，對照組與攻毒組細胞因子濃度峰值出現(xiàn)時間點不同。IL-1α、IFN-γ濃度在對照組都是

7、在24 h達到最大值，而攻毒組則是4h時最大值。IgY濃度在對照組24 h達到第一個峰值，在攻毒組則持續(xù)緩慢上升。IgM濃度在對照組變化不明顯，在攻毒組，細胞因子IgM濃度在2h快速升高到最大值，2h到4h濃度又快速下降，4h之后濃度緩慢下降;表明廣西黃雞早期免疫反應迅速，2h-4h屬于急性反應期，5d后屬于免疫相對穩(wěn)定期。
　　4.通過QRT-PCR方法檢測1日齡廣西黃雞感染腸炎沙門氏菌后0-21 dpi TAP1基因mRNA表

8、達水平變化，結果表明，TAP1在心臟、肝臟、胸腺、法氏囊四個不同組織中廣泛表達，但胸腺和法氏囊中整體表達量顯著高于其他組織(P＜0.05)。感染組和對照組TAP1基因表達量，感染組基因顯著表達高于對照組(P＜0.05）。對照組TAP1基因表達量隨日齡增加而增加，在3 dpi的表達量顯著升高，表明3d是免疫狀態(tài)切換的關鍵時期。對于不同感染時間TAP1表達水平比較，不同組織在3 dpi表達量均最高，在1 dpi的表達量顯著升高，3 dpi之

9、后表達量下降，進一步說明沙門氏菌感染后能引起雞只迅速產生免疫反應，且TAP1基因確實參與廣西黃雞的各種免疫反應。
　　5.采用QRT-PCR方法檢測廣西黃雞中突變型和野生型個體的TAP1 mRNA表達水平變化，在對照組中同一組織中，突變型與野生型個體在不同時間點的TAP1表達量差異不顯著（P＞0.05）。在攻毒組中，突變型與對照組野生型個體TAP1表達量也存在同樣趨勢，表明TAP1啟動子區(qū)在67309位置10bp的缺失突變對TAP