生物素化脂質體促進胰島素口服吸收的研究.pdf

1、蛋白質和肽類藥物口服給藥一直是藥劑學研究的熱點和難點，也是醫(yī)藥領域最具挑戰(zhàn)的前沿課題之一。然而，若要實現(xiàn)有效的口服遞送，必須克服該類藥物穩(wěn)定性差、胃腸道酶降解、膜滲透性差等多重障礙。近年來，以胰島素為主要模型藥物，發(fā)展了尤其包括納米遞送系統(tǒng)在內的多種促進吸收策略。然而，目前的研究現(xiàn)狀表明在提高胰島素口服生物利用度方面似乎遇到了一個瓶頸，因此亟待探索新的方法和策略以進一步增強這些納米給藥系統(tǒng)促進吸收的作用。本文的主要學術思路在于以生物素(

2、biotin)修飾脂質體，藉胃腸道上皮的生物素受體介導的內吞機制，促進胰島素的口服吸收，并對其口服吸收機制進行探索與驗證。
　　脂質體的生物素化通過在脂質體雙分子層膜上嵌入生物素-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(biotin-DSPE)而達成。Biotin-DSPE通過生物素的羧基與DSPE氨基的酰胺化反應合成，產物的結構經TLC、FTIR和1H NMR分析驗證。
　　采用逆向蒸發(fā)/超聲分散法制備載胰島素生物素化脂質體，以包封率和粒徑

3、為指標，分別考察了藥物/脂質比、磷脂/膽固醇比、初乳制備時有機相/水相體積比和脂質體水化時介質pH值等影響因素，對制備條件進行優(yōu)化。優(yōu)選條件下制備的生物素化脂質體胰島素包封率可達30％以上，脂質體粒徑在150 nm左右。圓二色譜(CD)檢測結果表明在各極端制備條件下制備的脂質體，胰島素的二級構象保持完好;大鼠皮下降糖實驗表明，制劑中胰島素的降糖作用與胰島素溶液無顯著性差異，表明胰島素的生物活性亦得以保存。生物素化可顯著提高脂質體的相變溫

4、度，當biotin-DSPE占脂質比例的20％以上時，其相變溫度可以達到40℃以上。相對于普通脂質體，生物素化脂質體的體外抗胃腸道酶解能力較強;4℃下短期放置其包封率和粒徑變化較小，表明其穩(wěn)定性較好。
　　正常大鼠模型上驗證了生物素化脂質體的口服降血糖作用及其影響因素，并在高血糖大鼠模型上考察了生物素化脂質體口服給藥后的大鼠體內血糖下降水平和血漿中胰島素濃度變化。結果表明，在正常大鼠體內生物素化脂質體比普通脂質體具有更加明顯的降血

5、糖作用，其相對藥理生物利用度為11.04％，而普通脂質體僅為2.09％。在對生物素化脂質體口服降血糖作用的影響因素考察中發(fā)現(xiàn)150 nm左右粒徑的脂質體粒徑具有較好的體內降血糖效應，脂質體中biotin-DSPE比例在20％以上時體內降血糖效應無顯著性差異，在低劑量下脂質體降血糖效應具有劑量依賴性，高劑量下則具有非線性特點;高血糖大鼠體內相對藥理生物利用度則達到12.09％，普通脂質體為6.36％;基于血漿胰島素水平的生物利用度為8.4

6、1％，而普通脂質體僅有3.44％。結果表明生物素化脂質體能夠顯著地促進胰島素的口服吸收，其作用溫和持久。
　　吸收機制研究方面，首先在Caco-2細胞模型上驗證了胃腸道吸收上皮生物素受體表達。在細胞水平上進行了胰島素生物素化脂質體在Caco-2細胞單層上的跨膜轉運研究，并通過TEER值的測定和CLSM觀察考察了脂質體對Caco-2細胞單層生理功能和緊密連接的影響，結果表明胰島素在脂質體的介導下其跨膜轉運能力得到顯著改善，尤其是生物

7、素修飾脂質體，其表觀滲透系數(shù)(Papp)是普通脂質體的1.87倍;脂質體對細胞緊密連接無顯著的影響。脂質體的細胞攝取研究表明脂質體生物素化后促進了標記物的細胞攝取量以及脂質體的內化，并具有溫度依賴性和與生物素競爭抑制性，這表明生物素化脂質體與普通脂質體之間存在不同的細胞攝取機制。在隨后的細胞內吞機制研究中發(fā)現(xiàn)，生物素化脂質體的內化是通過網格蛋白介導的內吞(clathrin-mediated endocytosis)途徑實現(xiàn)的，這些結果說

8、明生物素化脂質體的吸收是有生物素配體介導的、消耗能量的內吞轉運過程。CLSM熒光共區(qū)域化研究表明，脂質體是以完整納米粒進入細胞的，在細胞內經歷了早期內含體、后期內含體和溶酶體的遞送過程，這是受體介導內吞典型的轉運特征。在組織水平上，還進行了脂質體胃腸道轉運的實時離體成像觀察和跨上皮吸收的免疫熒光觀察，離體成像研究表明生物素化脂質體在胃腸道中具有較快的轉運速率，熒光免疫組化分析也表明了生物素化脂質體具有更好的上皮細胞膜滲透性。因而，對吸收

9、機制研究結果總結如下:生物素化脂質體促進胰島素口服吸收的機制主要是通過細胞通路途徑(transcellular)由生物素配體介導的內吞機制，而不是通過細胞旁路途徑(paracellular)打開細胞間緊密連接機制。盡管胃腸道對生物素化脂質體的吸收主要由受體介導的內吞完成的，但它的吸收是一個協(xié)同的過程，可能還伴隨著經M-細胞吸收的淋巴轉運過程，這是基于脂質體納米給藥系統(tǒng)本身的貢獻。
　　通過MTT細胞活力測定和細胞凋亡實驗考察了脂質