骨橋蛋白對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及遷移功能的影響研究.pdf

1、目的：
　　本實驗分別利用OPN慢病毒及蛋白處理骨髓間充質(zhì)干細胞，檢測內(nèi)源性及外源性 OPN表達差異導致的骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及遷移功能的變化，從而比較OPN對骨髓間充質(zhì)干細胞功能的影響。
　　方法：
　　1.分別分離培養(yǎng)新生OPN基因敲除型及野生型C57BL/6小鼠(鼠齡一天)的骨髓間充質(zhì)干細胞。培養(yǎng)后行流式、PCR、WB鑒定；
　　2.提取野生型成年小鼠OPN基因后構(gòu)建OPN質(zhì)粒并通過氯化鈣-氯喹法進行慢病毒

2、包裝；
　　3.慢病毒感染細胞，并行定量PCR及WB檢測各細胞內(nèi)OPN表達量的變化。
　　4.分別利用外源性O(shè)PN蛋白及OPN慢病毒處理細胞后用CCK8法檢測細胞的增殖能力改變。
　　5.同樣分組利用Transwell小室檢測骨髓間充質(zhì)干細胞遷移能力變化。
　　結(jié)果：
　　1.鏡下見骨髓內(nèi)分離的細胞生長狀態(tài)良好，呈漩渦狀排列。流式細胞儀檢測示細胞純度高，PCR、WB鑒定結(jié)果顯示OPN基因敲除型小鼠無OPN基

3、因及蛋白的表達，而野生型小鼠可正常表達；
　　2.從成年小鼠腎臟提取的OPN基因長度約為900bp。將此基因片段插入慢病毒載體后，經(jīng)氯化鈣-氯喹方法進行質(zhì)粒包裝后獲得滴度為2.5×108TU/ml的含OPN基因片段的慢病毒及空載體慢病毒；
　　3.慢病毒分別感染基因敲除型及野生型小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞后熒光鏡下可細胞均有熒光產(chǎn)生，經(jīng)定量PCR及WB檢測OPN呈梯度表達；
　　4.CCK8檢測結(jié)果提示無論是外源性 OPN