馬皰疹病毒1型神經(jīng)致病因子UL24基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、馬皰疹病毒1型(Equine Herpesvirus1，EHV-1)為引起馬屬動(dòng)物流產(chǎn)、癱瘓、共濟(jì)失調(diào)、神經(jīng)性腦脊髓炎的主要病原。EHV-1主要編碼6種調(diào)控蛋白，包括1個(gè)極早期蛋白(IE)、4個(gè)早期蛋白(IR2、EICP0、EICP22、EICP27)以及1個(gè)晚期蛋白(ETIF)。這些蛋白對(duì)自身病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起著關(guān)鍵作用。EHV-1的76個(gè)基因中，啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)明確的只有8個(gè)，分別為gK、IR5、IE、IR2、EICP0、EICP22、

2、EICP27和ETIF，EHV-1調(diào)控蛋白對(duì)自身啟動(dòng)子調(diào)控特征的研究更是十分有限。UL24基因在所有皰疹病毒科中高度保守性，其編碼的蛋白與神經(jīng)致病性密切相關(guān)。EHV-1神經(jīng)系統(tǒng)條件性致病依賴于病毒自身對(duì)UL24基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。目前，EHV-1 UL24基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道，本研究以馬皰疹病毒1型(EHV-1) UL24基因(ORF37)為研究對(duì)象，研究UL24啟動(dòng)子在EHV-1基因組中的精確定位以及UL24基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子

3、機(jī)制等科學(xué)問(wèn)題。
　　本研究中，利用5rRACE方法，確證了UL24開(kāi)放閱讀框上游的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)Tss1和Tss2，分別定位于基因組70118 bp和70397 bp;根據(jù)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)所在基因序列特征，構(gòu)建UL24啟動(dòng)子報(bào)告重組質(zhì)粒(pUL24Ⅰ、pUL24Ⅱ-1、pUL24Ⅱ-2、pUL24Ⅱ-3、pUL24Ⅱ-4、pUL24Ⅱ-5、pUL24Ⅱ-6、pUL24Ⅱ-7、pUL24Ⅱ-8)，利用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)確證了UL

4、24Ⅰ與UL24Ⅱ-5分別為Tss1和Tss2對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子，且二者所含核心元件不同，分別為TATA盒子和起始子(INR);同時(shí)克隆EHV-1調(diào)控蛋白基因，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒(pIE、pIR2、pEICP0、pEICP22、pEICP27、pEICP27-Flag、pETIF)，經(jīng)Western blotting檢測(cè)，驗(yàn)證了EHV-1調(diào)控蛋白的表達(dá);為了檢測(cè)調(diào)控蛋白對(duì)UL24啟動(dòng)子活性的影響，我們通過(guò)共轉(zhuǎn)染UL24啟動(dòng)子報(bào)告重組質(zhì)粒與調(diào)

5、控蛋白真核表達(dá)重組質(zhì)粒，利用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明:EHV-1六種調(diào)控蛋白對(duì)UL24的不同的啟動(dòng)子調(diào)控模式相似，啟動(dòng)子UL24Ⅰ和UL24Ⅱ-5在EICP0蛋白作用下，活性分別升高2.3倍和17.5倍;在EICP22蛋白作用下，活性分別升高2.4倍和6倍;在ETIF蛋白作用下，活性分別升高1.8倍和4倍。與之相反，啟動(dòng)子UL24Ⅰ和UL24Ⅱ-5在IR2蛋白作用下，活性分別下降43.4倍和26.3倍;在IE蛋白作用下，