利用孕婦血漿游離胎兒DNA行胎兒產(chǎn)前診斷的研究.pdf

1、1997年，Lo等利用普通聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在孕男胎的孕婦血漿中檢測到Y(jié)染色體性別決定基因(sex-determiningregionYgene，SRY)的特異性序列，確定了孕婦血漿中存在游離胎兒DNA(fetalDNA，fDNA)。此后進行了一系列利用fDNA進行性連鎖遺傳性疾病、RhD血型、妊娠并發(fā)癥和21三體綜合征等產(chǎn)前診斷的研究，其中RhD血型的產(chǎn)前診斷是歐洲首個臨床開展的以DNA為基礎(chǔ)的無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷常規(guī)項目。目前，

2、fDNA已經(jīng)成為無創(chuàng)傷性產(chǎn)前遺傳病基因診斷的重要物質(zhì)來源，為無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷開辟了新的途徑。 妊娠過程中，孕婦免疫系統(tǒng)接觸胎兒血細(xì)胞抗原(紅細(xì)胞、血小板)，胎兒血細(xì)胞可刺激孕母產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，引起新生兒溶血病(haemoliticdiseaseofthenewborn，HDN)和新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜(neonatalalloimmuethrombocytopenicpurpura，NAITP)等嚴(yán)重并發(fā)癥，產(chǎn)前獲取胎

3、兒遺傳物質(zhì)進行基因診斷是行之有效的預(yù)防方法。本研究利用孕婦血漿中的fDNA進行了產(chǎn)前胎兒紅細(xì)胞RhEe抗原和人類血小板抗原(humanplateletantigen，HPA)的基因診斷，具有一定的創(chuàng)新性和臨床意義。 在第一部分實驗中，以胎兒SRY基因為靶序列，建立了改良的酚/氯仿法從孕婦血漿中提取DNA，采用巢式PCR方法進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定。與隨訪結(jié)果相比，30例孕婦的診斷準(zhǔn)確性達93.3﹪，可應(yīng)用于無創(chuàng)傷性產(chǎn)前性連鎖

4、遺傳性疾病的診斷。 第二部分實驗的目的是利用孕婦血漿fDNA鑒定胎兒紅細(xì)胞RhEe血型的基因型。首先通過普通PCR擴增SRY基因以確認(rèn)fDNA的存在，然后采用PCR-序列特異性引物(PCR-SSP)方法擴增12例孕婦血漿中fDNA，以檢測胎兒RhEe血型抗原的基因表型，并對產(chǎn)前孕婦外周血和產(chǎn)后嬰兒外周血進行RhEe血清學(xué)分型，回顧性評價胎兒基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果證實本研究建立的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷胎兒RhEe血型抗原的基因型方法是

5、可行的，當(dāng)母親RhEe表型為純合子時，對血漿中胎兒RhEe行基因分型具有臨床意義。 在第三部分實驗中，建立了HPA-1～6、Gov系統(tǒng)的同步基因分型技術(shù)，以了解中國人群中HPA的基因分布情況。共設(shè)計合成21對序列特異性引物，探索最佳退火溫度，使HPA-1～6和Gov系統(tǒng)等位基因在同一條件下進行同步擴增，擴增產(chǎn)物在同一凝膠中進行同步電泳。此方法進行HPA基因分型準(zhǔn)確率可以達到100﹪，中國人群中Gov(HPA-15)抗原系統(tǒng)在臨床

6、上的意義較大。 第四部分實驗中，在第一、二、三部分實驗研究的基礎(chǔ)上，首次對孕婦血漿fDNA鑒定胎兒Gov基因型進行初步研究。從孕婦血漿中提取DNA后，對胎兒Gov基因進行PCR-SSP基因分型，并對產(chǎn)前孕婦外周血和產(chǎn)后嬰兒外周血進行Gov基因PCR-SSP基因分型，回顧性評價胎兒基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果證實所建立的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷胎兒Gov基因型的方法是可行的，當(dāng)母親Gov基因表型為純合子時，血漿中胎兒Gov基因分型具有臨床意義