人胚胎培養(yǎng)液氨基酸濃度和拉曼光譜特征與IVF-ET結局的關系.pdf

1、自首例試管嬰兒誕生以來，體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization andembryo transfer,IVF-ET)技術得到了廣泛的應用，妊娠率也有了很大提高，然而胚胎種植率卻仍徘徊在10％～30％左右。影響胚胎種植的因素是多方面的，而胚胎的質量是影響胚胎種植最重要的因素之一。目前，對胚胎質量的評估主要是通過形態(tài)學方法，這種方法雖能在一定程度上反映胚胎的發(fā)育潛能，但仍缺乏足夠的準確性并有一定的主觀性。為彌補其不

2、足，臨床工作中常需行多個胚胎移植，后者引起IVF-ET中多胎妊娠率明顯高于自然妊娠，眾所周知，多胎妊娠可致產(chǎn)科并發(fā)癥增加、患者的經(jīng)濟負擔加重。因此，探討一種客觀、無創(chuàng)的胚胎活力評估方法，提高胚胎活力評估的準確性，對于提高IVF-ET妊娠率、降低多胎妊娠率及減輕患者經(jīng)濟負擔等具有相當重要的意義。
　　 隨著胚胎培養(yǎng)體系的發(fā)展，學者們開始研究胚胎代謝與胚胎發(fā)育潛能之間的關系。一些研究提示，培養(yǎng)液中諸如葡萄糖、丙酮酸等代謝物的濃度與胚

3、胎活力有關。然而，由于檢測費用昂貴、技術復雜及耗時長等原因，這些技術未能得到臨床應用。21世紀初，有研究發(fā)現(xiàn)胚胎的氨基酸代謝水平與其發(fā)育潛能有關，并且氨基酸檢測技術相對簡單、快捷，測定胚胎氨基酸代謝水平可能成為評價胚胎活力的輔助方法。近年來，光譜技術由于快速、無創(chuàng)等優(yōu)點已廣泛應用于醫(yī)學領域，其中拉曼光譜因其受水信號影響小的特點更適用于液體樣品的分析。有研究發(fā)現(xiàn)胚胎培養(yǎng)液的拉曼光譜特征與胚胎的種植結局相關，然而，目前相關的研究主要側重于對

4、卵裂早期胚胎的評估，受精后第3-5天隨著胚胎基因組的激活，胚胎改造環(huán)境的能力增強，檢測此期胚胎的代謝水平可能更能反映胚胎的發(fā)育潛能，有可能提高評估的準確性。此外，在不同的培養(yǎng)條件下，胚胎的代謝情況亦可能存在差異。
　　 本研究使用高效液相色譜技術檢測人類體外受精的胚胎培養(yǎng)后培養(yǎng)液的氨基酸濃度，同時采用拉曼光譜技術檢測培養(yǎng)液的拉曼光譜特征，分析胚胎受精后第5天培養(yǎng)液中氨基酸的濃度、胚胎受精后第3天和第5天培養(yǎng)液的拉曼光譜特征與IV

5、F-ET結局的關系，間接評估胚胎代謝與胚胎活力的關系，以期為探討客觀、無創(chuàng)的胚胎活力評估方法提供新的證據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1.研究對象
　　 收集2009年4月至2009年11月于中山大學附屬第二醫(yī)院行IVF助孕的不孕夫婦，在患者知情同意的前提下，以其體外培養(yǎng)的胚胎及培養(yǎng)液為研究對象，共納入受精后第3天(D3)行胚胎移植的50例患者的99個胚胎和受精后第5天(D5)行胚胎移植的30例患者的60個胚胎。

6、
　　 2.標本收集及保存
　　 胚胎移出后，D3移植的胚胎收集其卵裂液，D5移植的胚胎分別收集其卵裂液和囊胚培養(yǎng)液，-80℃冰箱保存，待測。@23.標本檢測
　　 檢測日，標本于25℃解凍后，卵裂液行拉曼光譜分析，囊胚培養(yǎng)液取10μl行高效液相色譜測定20種游離氨基酸的濃度，余下行拉曼光譜分析。
　　 結果：
　　 1.患者基本情況分析
　　 妊娠組與未妊娠組比較，女方年齡、基礎FSH、

7、體重指數(shù)、周期數(shù)等均無顯著性差異(P均＞0.05)。
　　 2.囊胚培養(yǎng)液氨基酸濃度分析
　　 (1)D5胚胎移植，妊娠患者與未妊娠患者的囊胚培養(yǎng)液中谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸的濃度均較空白對照培養(yǎng)液明顯升高，而丙氨酰-谷氨酰胺的濃度則均較空白對照培養(yǎng)液明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)
　　 (2)D5胚胎移植，妊娠組胚胎的囊胚培養(yǎng)液中谷氨酰胺和丙氨酸的濃度均明顯低于未妊娠組(谷氨酰胺濃度的中位數(shù)分別為

8、60.8和84.7μmol/L，丙氨酸濃度的中位數(shù)分別為61.9和92.3μmol/L)，差異均有統(tǒng)計學意義(P分別為0.029和0.023)。
　　 (3)單因素logistic回歸分析顯示，囊胚培養(yǎng)液中谷氨酰胺、丙氨酸的濃度、D5胚胎分級與妊娠呈負相關(相對危險度[OR]分別為0.99、0.99和0.45，P分別為0.032、0.025和0.027)；色氨酸的濃度與妊娠呈正相關(OR=1.19，P=0.044)。多因素回歸分

9、析在校正D3細胞數(shù)、D3胚胎分級和D5胚胎分級的影響后，谷氨酰胺和丙氨酸的濃度仍然與妊娠呈負相關(OR分別為0.99和0.98，P分別為0.024和0.019)。
　　 3.胚胎培養(yǎng)液拉曼光譜分析
　　 (1)D3胚胎移植，妊娠組卵裂液拉曼光譜在拉曼位移2828.94-2823.85cm-1、2814.91-2804.69cm-1、2712.07-2706.89cm-1等19處的信號較未妊娠組明顯增強，而在3037.51

10、-3030.07cm-1、3016.42-2966.56cm-1、2961.55-2933.97cm-1等27處的信號則較未妊娠組明顯減弱(P均＜0.05)。ROC曲線分析，D3胚胎分級預測種植的靈敏度為52.1％，特異度為87.5％，曲線下面積為0.713；結合拉曼光譜特征和D3胚胎分級預測種植的靈敏度為87.5％，特異度為64.6％，曲線下面積為0.834。
　　 (2)D5胚胎移植，妊娠組卵裂液拉曼光譜在拉曼位移3023.

11、59-3008.68cm-1、2645.46-2628.47 cm-1、2602.24-2587.78 cm-1等14處的信號較未妊娠組明顯增強，而在2864.26-2842.66cm-1、2694.93-2691.04cm-1等19處的信號較未妊娠組明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。
　　 (3)D5胚胎移植，妊娠組囊胚培養(yǎng)液中拉曼信號明顯強于未妊娠組的位移段有1166.25-1177.24cm-1、1351.27

12、-1363.56cm-1、1414.07-1424.75cm-1、1625.01-1627.98cm-1、1839.32-1843.66cm-1、2711.71-2719.47cm-1，信號明顯弱于未妊娠組的位移區(qū)段有981.89-985.11cm-1、2266.53-2254.17cm-1(P均＜0.05)。
　　 結論：
　　 1.囊胚培養(yǎng)液中部分氨基酸的濃度與體外受精-胚胎移植后能否妊娠有關，提示囊胚培養(yǎng)液中部分氨