HBV基因組HNF3結(jié)合位點(diǎn)的突變對(duì)肝細(xì)胞核因子3β抑制HBV轉(zhuǎn)錄復(fù)制作用的影響.pdf

1、肝富集轉(zhuǎn)錄因子是一類具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的蛋白質(zhì)分子，主要存在于肝臟，能與HBV基因組的4個(gè)啟動(dòng)子結(jié)合，對(duì)HBV的基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控作用。其中，核激素受體HNF4和RXR α/PPAR α能支持HBv在非肝源細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，為HBV前基因組RNA合成和病毒復(fù)制所必需，而肝細(xì)胞核因子3(HNF3)具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。 為闡明HNF3對(duì)HBV的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究通過(guò)構(gòu)建HBV基因組多個(gè)HNF3結(jié)合位點(diǎn)(包括多聚酶編碼區(qū)PORF、PSl

2、p和Sp區(qū)HNF3結(jié)合位點(diǎn))突變的復(fù)合突變型重組質(zhì)粒，阻斷HNF3 β與這些位點(diǎn)的結(jié)合，觀察是否會(huì)影響HNF3 β對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的抑制作用，以了解HNF3β抑制HBV復(fù)制的作用位點(diǎn)和可能的機(jī)理，從而為尋找抗HBV治療的作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。 方法 1．用帶有單個(gè)HNF3結(jié)合位點(diǎn)突變的突變型HBV重組質(zhì)粒(分別為含多聚酶編碼區(qū)PORF、PSlp區(qū)和Sp區(qū)HNF3結(jié)合位點(diǎn)單個(gè)突變的突變型重組質(zhì)粒即：pHBV4．lPpH

3、NF3mut，pHBV4．lPSlpHNF3mut和pHBV4．lSpHNF3mut)為模板，用限制性內(nèi)切酶BspEl、Bsml及Hhal酶切，獲取并純化含多聚酶編碼區(qū)PORF、PSlp區(qū)和Sp區(qū)HNF3結(jié)合位點(diǎn)突變的DNA片段，然后進(jìn)行基因重組，分別構(gòu)建兩個(gè)和三個(gè)HNF3結(jié)合位點(diǎn)復(fù)合突變的突變型重組質(zhì)粒。將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌內(nèi)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用酶切和基因測(cè)序鑒定所構(gòu)建HNF3結(jié)合位點(diǎn)復(fù)合突變的突變型HBV重組質(zhì)粒。

4、 2．轉(zhuǎn)染采用改良磷酸鈣法。為了研究肝富集轉(zhuǎn)錄因子HNF3 β、HNF4或RXR α／PPAR α在HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中的作用，我們選擇非肝源細(xì)胞株鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3作為受體細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)染的DNA混合液中，HBV重組質(zhì)粒劑量為15μg、肝富集轉(zhuǎn)錄因子HNF3 β、HNF4以及RXR β／PPAR α表達(dá)質(zhì)粒劑量為2μg。對(duì)照采用空載質(zhì)粒。于轉(zhuǎn)染3d，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA和HBV DNA復(fù)制中間體。 3．用Nort

5、hem吸印雜交檢測(cè)3.5kb，2.4kb，2.1kb，和0.7kb HBV RNA的轉(zhuǎn)錄水平，Southern吸印雜交檢測(cè)HBVDNA復(fù)制中間體水平。 結(jié)果 1．通過(guò)酶切，獲取含有多聚酶編碼PORF、PSlp區(qū)和Sp區(qū)三個(gè)HNF3結(jié)合位點(diǎn)突變的DNA片段，經(jīng)基因重組后，構(gòu)建四個(gè)復(fù)合突變型質(zhì)粒。然后經(jīng)酶切和基因測(cè)序鑒定證明成功構(gòu)建了四個(gè)含HNF3結(jié)合位點(diǎn)復(fù)合突變的突變型重組質(zhì)粒分別為：(1)含多聚酶編碼PORF、PSlp

6、區(qū)兩個(gè)HNF3結(jié)合位點(diǎn)復(fù)合突變【pHBV4.1(Pp+PSlp)HNF3mut】；(2)含多聚酶編碼P ORF和Sp區(qū)兩個(gè)HNF3結(jié)合位點(diǎn)復(fù)合突變【pHBV4.1(Pp+Sp)HNF3mut】；(3)含PSlp和Sp區(qū)兩個(gè)HNF3結(jié)合位點(diǎn)復(fù)合突變【pHBV4.1(PSlp+Sp)HNF3mut】(4)含多聚酶編碼PORF、PSlp和Sp區(qū)三個(gè)HNF3結(jié)合位點(diǎn)復(fù)合突變【pHBV4.1(Pp+PS1p+Sp)HNF3mut】的突變型重組質(zhì)粒

7、。 2．觀察在非肝源性細(xì)胞鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞中，肝富集轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，結(jié)果顯示：HNF4或RXR α／PPARα能介導(dǎo)HBV在非肝源性細(xì)胞中3.5kb HBV RNA的轉(zhuǎn)錄和HBV DNA復(fù)制，HNF3 β能抑制HNF4或RXR α／PPAR α介導(dǎo)的HBV3.5kb RNA的轉(zhuǎn)錄和HBVDNA的復(fù)制。與未共轉(zhuǎn)染HNF3 β相比，分別下降2～3倍和3～20倍。顯示HNF3 β對(duì)HBV的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

8、 3．四個(gè)復(fù)合突變型重組質(zhì)粒和野生型一樣，均能在肝源性細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，同時(shí)也能在HNF4或RXRα／PPAR α介導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。且復(fù)制水平與野生型pHBV4.1相似。表明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒中HNF3結(jié)合位點(diǎn)的突變對(duì)HBV的復(fù)制水平無(wú)明顯影響。 4．觀察肝富集轉(zhuǎn)錄因子HNF3 β對(duì)三個(gè)單個(gè)HNF3結(jié)合位點(diǎn)突變的突變型HBV重組質(zhì)粒(分別為含多聚酶編碼區(qū)PORF、PSlp和Sp區(qū)HNF3結(jié)合位點(diǎn)突變)的

9、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的調(diào)控，結(jié)果顯示，HNF3 β仍抑制單個(gè)HNF3結(jié)合位點(diǎn)突變的HBV重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。表明在該區(qū)改變單個(gè)HNF3結(jié)合位點(diǎn)，不能阻止HNF3 β對(duì)HBV的抑制作用。 5．進(jìn)一步觀察肝富集轉(zhuǎn)錄因子HNF3 β對(duì)多聚酶編碼區(qū)PORF、PSlp和Sp區(qū)HNF3結(jié)合位點(diǎn)復(fù)合突變的四個(gè)突變型HBV重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的影響，結(jié)果顯示HNF3 β仍降低3.5kb HBV RNA的轉(zhuǎn)錄水平，抑制HBV的復(fù)制，與未共轉(zhuǎn)染HNF3 β

10、相比，分別下降2-4倍，5-25倍。表明該區(qū)的HNF3結(jié)合位點(diǎn)的復(fù)合突變也未能阻止HNF3 β對(duì)HBV復(fù)制的抑制作用。 結(jié)論 HBV多聚酶編碼PORF、PSlp和Sp區(qū)HNF3結(jié)合位點(diǎn)，無(wú)論其中一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)突變、或同時(shí)兩個(gè)、或同時(shí)三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的復(fù)合突變所構(gòu)建的HBV重組質(zhì)粒，HNF3 β仍能抑制HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。提示：多聚酶編碼區(qū)PORF、PSlp和Sp區(qū)HNF3結(jié)合位點(diǎn)的突變不能阻斷HNF3 β對(duì)HBV復(fù)制的抑制作