大豆異黃酮對大鼠早期慢性移植腎病的干預作用及其機制的研究.pdf

1、研究背景及意義 腎移植是慢性腎功能衰竭患者最有效的治療手段之一。近年來，隨著免疫抑制藥物的發(fā)展，腎移植急性排斥反應明顯下降，移植腎的一年存活率大大提高，但移植腎的長期存活率并未得到明顯改善，慢性移植腎病(ChronicAllograftNephropathy，CAN)是阻礙移植腎長期存活最主要的原因。CAN主要表現(xiàn)為移植后數(shù)月或數(shù)年出現(xiàn)移植腎功能進行性減退，伴有慢性間質纖維化，小管萎縮，血管阻塞性病變以及腎小球硬化等病理改變。近

2、期研究證實：移植腎組織中的單個核細胞浸潤以及血管平滑肌細胞增殖和向內膜下移行是CAN發(fā)病早期兩個最重要的病理變化。同時有研究表明：在CAN大鼠模型中，移植后早期腎組織中基質金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases-9，MMP-9)和轉化生長因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)的表達水平明顯增高，并且與CAN早期病理改變呈正相關關系，提示MMP-9和TGF-β1在CAN

3、早期發(fā)病機制中有重要作用。 CAN一旦發(fā)生，將持續(xù)進展。迄今為止，尚無任何藥物能真正有效地治療CAN，關鍵在于早期預防。盡管強有力的新型免疫抑制劑的開發(fā)和應用在CAN的防治方面取得了一定的效果，但長期用藥治療時毒副作用較多，而且費用十分昂貴，因而迫切需要尋求更安全、有效、并且價廉的治療新方法。具有天然雌激素活性的大豆異黃酮(soybeanisoflavones)已經被證實可以通過降血脂、抗氧化、抑制炎癥細胞因子的產生以及抑制細胞

4、增殖等多種途徑而發(fā)揮腎臟保護功能。由于這些免疫抑制與非免疫抑制效應正好針對了CAN的發(fā)病機制，我們預測大豆異黃酮有可能對CAN的重要發(fā)病環(huán)節(jié)起作用，能夠保護移植腎功能，延緩CAN的發(fā)生和發(fā)展。重要的是異黃酮來源于普通的食物—大豆，廉價易得，長期使用無任何毒副作用，有望開創(chuàng)CAN防治的新思路。 本研究擬通過觀察大豆異黃酮對CAN早期腎功能、腎組織形態(tài)學方面的影響，來證實大豆異黃酮營養(yǎng)干預治療對CAN的有效性；同時通過觀察CAN早期

5、移植腎間質中MMP-9和TGF-β1表達水平的變化，初步探索大豆異黃酮延緩CAN進展可能的作用機制，為臨床應用大豆異黃酮防治早期CAN提供科學依據(jù)。 實驗方法 1.制作F344-LewisCAN大鼠模型15只，按2：1的比例隨機分成兩組：CAN治療組10只，CAN對照組5只。另外，F(xiàn)344和Lewis大鼠各5只行單腎切除作為假手術對照組。治療組大鼠喂食含大豆異黃酮的飼料，對照組和假手術組喂食不含異黃酮的飼料。實驗周期12

6、周。 2.CAN動物模型制作：近交系同種Lewis大鼠接受Fisher大鼠，參照White氏方法，用顯微外科技術做左腎原位移植術。 3.分別于實驗的第4、8和12周，測量體重；收集24小時尿進行蛋白定量檢查；采集鼠尾靜脈血進行血清肌酐和膽固醇測定，觀察大豆異黃酮對CAN早期移植腎功能和血脂的影響。 4.在實驗的第12周末收獲動物，取移植腎組織進行組織病理學檢查，觀察大豆異黃酮對CAN早期移植腎的組織形態(tài)學變化的影

7、響。 5.應用免疫組織化學染色技術，檢測CAN大鼠移植12周后移植腎間質MMP-9和TGF-β1表達水平的變化，初步探索大豆異黃酮對早期CAN可能的作用機制。結果 1.成功制作了CAN大鼠模型。各組大鼠在性別、周齡方面無差別。實驗期間各組大鼠體重增長情況類似，相同時點的體重比較無差異。 2.實驗12周時，CAN治療組和對照組的24小時蛋白尿分別為16.71±3.77mg/d和21.7±7.47mg/d，均明顯高于

8、與假手術組(P＜0.05)，但CAN治療組增加的程度低于CAN對照組，兩組之間有顯著性差異(P=0.017)。實驗期間，CAN對照組的血清肌酐水平呈持續(xù)上升趨勢，而CAN治療組的血清肌酐水平和假手術對照組接近。第8周時，CAN治療組和對照組的血清肌酐分別為69.68±5.27μmol/L和81.24±12.64μmol/L，兩者之間有差異(P=0.031)，第12周時兩者之間的差異更加顯著(P=0.008)。 3.實驗期間CAN

9、治療組的膽固醇水平穩(wěn)定，而CAN對照組的膽固醇水平出現(xiàn)持續(xù)增高的趨勢。第12周時，CAN對照組的膽固醇水平(2.26±0.38mmol/L)明顯高于CAN治療組(1.60±0.15mmol/L，P=0.001)和假手術組(P＜0.05)。 4.CAN大鼠模型移植12周的腎組織病理表現(xiàn)有：腎小球不同程度的系膜增生，球囊粘連和局灶節(jié)段性硬化；小管間質明顯的單個核細胞浸潤，局部小管萎縮，局灶性纖維化，小動脈內膜增厚，中層平滑肌細胞增殖

10、并向內膜移行。CAN治療組的病理表現(xiàn)僅為輕度的小管間質單個核細胞浸潤，偶見的小灶性間質纖維化，腎小球及小血管病變不明顯。CAN治療組在慢性病變、腎組織單個核細胞浸潤以及腎間質纖維化評分上明顯優(yōu)于CAN對照組，均存在顯著性差異(P值分別為0.009；0.008和0.047)。 5.移植12周時CAN對照組的腎間質MMP-9表達水平上調(5.37±0.79)，并且明顯高于CAN治療組(4.01±0.73；P=0.007)以及假手術組

11、F344大鼠(P=0.001)和Lewis大鼠(P=0.002)。CAN對照組的TGF-β1表達水平(2.54±0.67)上調，也高于CAN治療組(1.81±0.42；P=0.026)以及假手術組F344大鼠(P=0.024)和Lewis大鼠(P=0.035)。CAN大鼠模型12周移植腎組織間質中MMP-9和TGF-β1表達水平呈正相關關系(R=0.603，P=0.022)。 結論 1.本研究成功建立了F344-Lewi

12、s大鼠CAN模型。該模型在12周時，腎組織病理的顯著特征為：腎小管間質的單個核細胞浸潤，血管平滑肌細胞的增殖和移行，與文獻報道相一致，提示該時段為CAN的早期階段。 2.CAN大鼠移植12周時，24小時蛋白尿和血清肌酐水平明顯增高，大豆異黃酮治療明顯減緩了CAN大鼠血清肌酐的增長，在改善蛋白尿方面也有一定的作用。實驗期間，大豆異黃酮治療組顯著有效地控制了膽固醇水平的增長。大豆異黃酮對膽固醇良好的調節(jié)作用可能參與了對CAN大鼠移植

13、腎的保護機制。 3.大豆異黃酮治療12周，有效地改善了CAN大鼠腎組織的單個核細胞浸潤、血管平滑肌細胞的增殖和移行、慢性病變Banff評分以及腎問質的纖維化程度。與此同時，大豆異黃酮可以干預下調CAN早期腎問質MMP-9和TGF-β1的表達水平，可能是大豆異黃酮延緩CAN移植腎組織早期病變的機制之一。 4.由于大豆異黃酮來源于天然食物，無任何毒副作用，用飲食營養(yǎng)干預的模式對需要長期用藥的CAN進行治療，不失為一種安全有效