利用精子載體方法研制人組織型纖溶酶原激活劑突變體轉基因羊乳腺生物反應器.pdf

1、利用轉基因動物乳腺生產醫(yī)藥用蛋白，具有產量高和生產成本低等明顯優(yōu)勢，前景普遍看好，但動物乳腺生物反應器的獲得有賴于可靠的轉基因動物生產制備技術作保證。 精子介導基因轉移(Sperm-mediatedgenetransfer,SMGT)被認為是目前操作最簡單的轉基因動物生產技術，但該方法的重復性差、實驗結果不穩(wěn)定，因此也是一種不成熟的技術體系?；赟MGT的不成熟性，本實驗將對SMGT的幾個關鍵環(huán)節(jié)進行研究，以期建立穩(wěn)定、高效的S

2、MGT技術平臺，同時利用該技術平臺研制人組織型纖溶酶原激活劑突變體(variantformofhumantissue-typeplasminogenactivator,mt-PA)轉基因羊乳腺生物反應器，為安全高效的溶栓藥物mt-PA規(guī)?；a奠定基礎。實驗結果如下： 1)山羊精子可自發(fā)性結合外源DNA，精子對外源DNA的結合和內化能力在不同個體間差異顯著(P＜0.01)。對于同一供體的精子而言，阻止DNA結合的最主要因素是精漿

3、，離心洗滌后，結合率和內化率可提高數(shù)倍。 2)死精子同樣能結合外源DNA，但不能將其內化，反復凍融導致質膜破裂的死精子具有更高的結合率，而且與動物個體無關。 3)精漿既可能與DNA形成復合物，改變DNA的物理性質，又可能對游離DNA產生降解，精漿的作用效應呈濃度和時間依賴性；EGTA對精漿的復合效應和降解效應有明顯的抑制作用。 4)內化進入精細胞中的外源DNA大部分將被降解，EGTA/ATA能有效保護內化DNA的

4、完整性而不影響精子的其他生物學特性。 5)轉染精子用于體外受精，報告基因GFP可被精子介導進入卵母細胞，并在早期胚胎中表達，胚胎陽性率和GFP表達率與精子結合外源DNA的能力相關。 6)精子與山羊乳腺特異性表達pBGC-mtPA線性化質粒DNA共同孵育后，人工受精得到129只羔羊，其中24只PCR陽性(陽性率18.6％)，15只Southernblot陽性(陽性率11.6％，15/129)。但轉染精子受精能力下降，畸形羔