沼澤紅假單胞菌輔酶Q10發(fā)酵過程工程研究.pdf

1、CoQ10是一種存在于人體細胞內(nèi)的天然脂溶性物質(zhì)。其擔負著重要的生理生化作用,比如是呼吸鏈中重要的電子載體,也是生物體中一種重要的抗氧化劑而使細胞膜脂免于過氧化和保持細胞膜功能的穩(wěn)定性等。由于CoQ10具有多方面作用,因此目前它有多方面的臨床應用,如用于治療高血壓、腦血管損傷、貧血癥、肌肉萎縮癥及牙槽膿溢等。CoQ10越來越受到人們的重視,其消耗量正逐年上升。微生物法是目前生產(chǎn)CoQ10的主要方法,其產(chǎn)品比化學法安全可靠且生物利用度高,

2、因此售價要好。
　　本研究用Van Niel紫色非硫光合細菌富集培養(yǎng)基對采自武漢市東湖污泥進行厭氧光照培養(yǎng),并用Van Nile紫色非硫細菌分離用培養(yǎng)基進行多次劃線分離,獲得1株菌落生長旺盛且CoQ10含量較高的菌株(5.2mg·g-1),對其進行了菌株形態(tài)、生理生化及分子鑒定和遺傳穩(wěn)定性實驗。結(jié)果表明該菌株歸屬于沼澤紅假單胞菌,擬命名為沼澤紅假單胞菌J(Rhodopseudomonas palustris J)。
　　以沼

3、澤紅假單胞菌J為出發(fā)菌株,采用基于高通量篩選技術的高效定向育種方法,設計出抗高濃度對羥基苯甲酸,抗L-乙硫氨酸與抗維生素K3三種篩選方法,比較高效地定向選出具有三抗特性的突變株J001,其輔酶Q10含量達19.3mg·g-1,是出發(fā)菌株J的3.71倍,且遺傳穩(wěn)定性良好。
　　通過以生物量及輔酶Q10合成為考察指標對沼澤紅假單胞菌J001250ml搖瓶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,結(jié)果表明其發(fā)酵最佳pH值為6.5-7.5,溫度為28-31℃,

4、搖床轉(zhuǎn)速100r·min-1,搖瓶裝液量為200ml,接種量達10％時可直接進入對數(shù)生長期;碳源以NaAc較好,氮源以(NH4)2SO4和NH4Cl較好,磷源用量對考察指標影響不明顯;用中心組合設計響應曲面法對碳氮源用量進行了優(yōu)化,當NaAc濃度X1=5.39(g·l-1),(NH4)2SO4濃度X2=0.385(g·l-1)即碳氮比為14/1時,生物量Y1有極大值為1.012±0.041(g·l-1);當X1=5.70(g·l-1),

5、X2=0.365(g·l-1)即碳氮比為15.6/1時,輔酶Q10產(chǎn)量Y2有極大值為19.8±0.6(mg·l-1)。不同供氧量試驗結(jié)果表明,相對較高的供氧量,利于沼澤紅假單胞菌J001菌體的生長,而較低的供氧量有利于菌胞輔酶Q10含量的提高。采用具有先強后弱自調(diào)氧氣作用的密閉玻璃瓶試驗,最佳裝液比為40%,生物量及輔酶Q10含量與產(chǎn)量分別為0.940g·l-1,76.4mg·g-1,71.8mg·l-1,與200ml裝液量搖瓶發(fā)酵處理

6、相比較,除生物量接近外,其輔酶Q10含量與產(chǎn)量高達搖瓶發(fā)酵的3.86和3.82倍;采用分段供氧和補加不同量醋酸鈉的兩步發(fā)酵模式進行了5升發(fā)酵罐試驗,結(jié)果表明在細胞生長期間(對數(shù)生長末期前)維持45%的溶氧量,對數(shù)生長末期后(接種后培養(yǎng)42h)調(diào)至15%的溶氧量并補加2.0%的醋酸鈉效果最好,其最大生物量為1.31g·l-1,比始終保持45%DO的分批發(fā)酵提高28%;最大輔酶Q10產(chǎn)量為89.1mg·l-1,比45%DO的分批發(fā)酵提高5.

7、85倍;總的輔酶Q10生產(chǎn)速率為1.142mg·l-1·h-1,比45%DO的分批發(fā)酵提高4.26倍。
　　對輔酶Q10的發(fā)酵過程進行了檢測,并通過計算機軟件處理,得到了沼澤紅假單胞菌J001搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10的細胞生長、底物消耗和產(chǎn)物生成三個動力學方程。
　　通過添加對莽草酸途徑、PPP途徑、甲硫氨酸途徑中的某些酶的活性或合成有影響的物質(zhì),開展了輔酶Q10代謝調(diào)控的研究。結(jié)果表明:A色氨酸對輔酶Q10的合成有較強的抑制

8、作用,培養(yǎng)基期間添加苯丙氨酸(100mg·l-1)+酪氨酸(150mg·l-1)有利于該菌株輔酶Q10的合成,提高29.3%輔酶Q10產(chǎn)量。B蘇氨酸、異亮氨酸與賴氨酸對輔酶Q10的合成有抑制作用,說明菌株J001的天門冬氨酸激酶也受蘇氨酸、異亮氨酸與賴氨酸的抑制或阻遏,從而影響到甲硫氨酸合成,最終影響輔酶Q10的合成。Cβ-胡蘿卜素和番茄紅素對菌株J001輔酶Q10生物合成有抑制作用,抑制濃度均為:≥25mg·l-1,番茄紅素的抑制效果

9、大于β-胡蘿卜素;而茄尼醇有促進作用,單獨添加時以125mg·l-1較好,可提高輔酶Q10產(chǎn)量29.8%。D茄尼醇、對羥基苯甲酸、甲硫氨酸分別是PPP途徑、莽草酸途徑、甲硫氨酸途徑的代謝產(chǎn)物,是生物合成輔酶Q10所需醌核環(huán)、癸異戊二烯側(cè)鏈、甲基供體SAM三者的直接原料。通過響應曲面法研究了茄尼醇(X1)、對羥基苯甲酸(X2)和甲硫氨酸(X3)三因素對菌株J001輔酶Q10產(chǎn)量(Y)的協(xié)同影響和進行優(yōu)化,當茄尼醇124.8mg·l-1,對