n-6-n-3多不飽和脂肪酸構(gòu)成對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素和PPARγ表達(dá)的調(diào)節(jié)研究.pdf

1、背景：
　　 隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、生活水平的提高，生活方式的改變和生活節(jié)奏的加快，肥胖的發(fā)病率近年來(lái)呈現(xiàn)急劇上升的趨勢(shì)，并且由肥胖導(dǎo)致的代謝紊亂疾病的發(fā)病率也隨之增加，肥胖及其相關(guān)疾病的研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界和營(yíng)養(yǎng)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)的研究表明，脂肪組織不僅可以?xún)?chǔ)存能量，還具有內(nèi)分泌的功能。脂聯(lián)素(adiponectin，APN)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的由脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)糖代謝和能量平衡、改善胰島素敏感性和抗動(dòng)脈粥樣硬化等方面

2、的作用倍受關(guān)注。n-6和n-3系列多不飽和脂肪酸(PUAFs)在調(diào)節(jié)糖脂代謝和脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用，現(xiàn)有研究也大多數(shù)支持改變膳食脂肪酸構(gòu)成能夠改善由肥胖引起的相關(guān)代謝性疾病，并且觀察到總是伴隨著體內(nèi)脂聯(lián)素水平的改變。但n-6/n-3多不飽和脂肪酸構(gòu)成對(duì)脂聯(lián)素的調(diào)節(jié)作用尚不明確。
　　 目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外培養(yǎng)的3T3-L1脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察不同比例、不同濃度的n-6/n-3多不飽和脂肪酸構(gòu)成對(duì)脂聯(lián)素

3、表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)能提高脂聯(lián)素表達(dá)的適宜脂肪酸比例和濃度，并初步探討n(yōu)-6/n-3多不飽和脂肪酸調(diào)節(jié)脂聯(lián)素表達(dá)的分子機(jī)理。其研究結(jié)果將為肥胖相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供新的思路和科學(xué)依據(jù)，也為確定膳食中n-6/n-3脂肪酸的適宜構(gòu)成提供新的重要的參考依據(jù)，有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 方法：
　　 1.以體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，n-6系的亞油酸(Linoleic acid，LA)、n-3系

4、的二十二碳六烯酸(Docosahe--xaenoic acid，DHA)為受試物，觀察經(jīng)不同比例（LA/DHA為1∶1，5∶1，10∶1，20∶1和30∶1）;一定濃度(25、50、100、200、400μmol/L)的LA、DHA處理后，3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素及PPARγ基因表達(dá)水平的變化（Realtime PCR相對(duì)定量法），觀察各受試物是否通過(guò)PPARγ來(lái)影響脂聯(lián)素的表達(dá);
　　 2.觀察經(jīng)不同比例（LA/DHA為1∶

5、1，5∶1，10∶1，20∶1和30∶1）;一定濃度(25、50、100、200、400μmol/L)的LA、DHA處理后，3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素蛋白表達(dá)水平的變化（western-blotting相對(duì)定量法）;
　　 3.所得數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析。如果方差齊，組間比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，兩兩比較采用LSD T-test或dunnett T-

6、test，如果方差不齊，運(yùn)用Welch法和Dunnett's T3法分別進(jìn)行組間比較和兩兩比較。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異顯著。
　　 結(jié)果：
　　 1.n-6/n-3PUFAs構(gòu)成對(duì)脂聯(lián)素及PPARγ mRNA表達(dá)的影響
　　 1.1 n-6/n-3PUFAs為1∶1時(shí)對(duì)脂聯(lián)素及PPARγ mRNA表達(dá)的影響以不同濃度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-

7、3PUFAs(1∶1)分別處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞24h，各濃度組脂聯(lián)素mRNA表達(dá)均增加，分別比對(duì)照組增加118.18％(p=0.001)、152.73％(p=0.000)、154.55％(p=0.000)、56.36％(p＞0.05)、38.18％(p＞0.05);在25、50、100μmol/L時(shí)表達(dá)增加最顯著。
　　 在濃度為50、100μmol/L時(shí)，PPARγ mRNA表達(dá)顯著增加，與對(duì)照組相比分別增108.33

8、％(p=0.008)和80.56％(p=0.045);其余濃度表達(dá)無(wú)顯著差異。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，脂聯(lián)素mRNA表達(dá)與PPARγ mRNA表達(dá)總體趨勢(shì)存在顯著正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)系數(shù)r=0.863，P=0.000。
　　 1.2 n-6/n-3PUFAs為5∶1時(shí)對(duì)脂聯(lián)素及PPARγ mRNA表達(dá)的影響以不同濃度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(5∶1)分別處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)

9、胞24h，在濃度為25、50、100μmol/L時(shí)，脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)均高于對(duì)照組，在25μmol/L時(shí)最為顯著，比對(duì)照組增加66％(p=0.000);隨著濃度的增加，脂聯(lián)素mRNA表達(dá)下降，在400μmol/L時(shí)顯著低于對(duì)照組，減少78％(p=0.000)。
　　 在濃度為25、50μmol/L時(shí)，PPARγ mRNA的表達(dá)增加，在50μmol/L顯著增加，比對(duì)照組增加64.36％(p=0.003);隨著濃度的繼續(xù)增加，PP

10、ARγ mRNA表達(dá)均下降，在200、400μmol/L時(shí)，分別比對(duì)照組減少44.55％(p=0.029)和55.45％(p=0.008)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，脂聯(lián)素mRNA表達(dá)與PPARγ mRNA表達(dá)總體趨勢(shì)存在顯著正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)系數(shù)r=0.590，P=0.010。
　　 1.3 n-6/n-3PUFAs為10∶1時(shí)對(duì)脂聯(lián)素及PPARγ mRNA表達(dá)的影響以不同濃度(25、50、100、200、400μmol/L)的

11、n-6/n-3PUFAs(10∶1)分別處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞24h，在濃度為50μmol/L時(shí)脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)顯著增加，比對(duì)照組增加50.85％(p=0.019);其他濃度組PPARγ mRNA表達(dá)均下降，當(dāng)濃度為200、400μmol/L時(shí)，表達(dá)顯著下降，比對(duì)照組分別減少13.56％(p=0.001)和77.97％(p=0.001)。
　　 在濃度為50μmol/L時(shí)，PPARγ mRNA的表達(dá)比對(duì)照組增加38.1

12、0％(p＞0.05);其他濃度組PPARγ mRNA表達(dá)均下降，當(dāng)濃度為400μmol/L時(shí)，表達(dá)顯著下降，比對(duì)照組減少65.48％(p=0.003)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，脂聯(lián)素mRNA表達(dá)與PPARγ mRNA表達(dá)總體趨勢(shì)存在顯著正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)系數(shù)r=0.791，P=0.000。
　　 1.4 n-6/n-3PUFAs為20∶1時(shí)對(duì)脂聯(lián)素及PPARγ mRNA表達(dá)的影響以不同濃度(25、50、100、200、400μm

13、ol/L)的n-6/n-3PUFAs(20∶1)分別處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞24h，與對(duì)照組相比，在濃度為50μmol/L時(shí)，脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)增加，但無(wú)顯著差異;其他濃度組脂聯(lián)素的表達(dá)均下降，當(dāng)濃度為200、400μmol/L時(shí)，表達(dá)顯著下降，比對(duì)照組分別減少13.56％(p=0.004)和77.97％(p=0.002)。
　　 在濃度為50μmol/L時(shí)，PPARγ mRNA的表達(dá)增加，但無(wú)顯著差異;其他濃度組PPAR

14、γ mRNA表達(dá)均下降，當(dāng)濃度為200、400μmol/L時(shí)，表達(dá)顯著下降，比對(duì)照組分別減少50％(p=0.004)和60.29％(p=0.001)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，脂聯(lián)素mRNA表達(dá)與PPARγ mRNA表達(dá)總體趨勢(shì)存在顯著正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)系數(shù)r=0.970, P=0.000。
　　 1.5 n-6/n-3PUFAs為30∶1時(shí)對(duì)脂聯(lián)素及PPARγ mRNA表達(dá)的影響以不同濃度(25、50、100、200、400μm

15、ol/L)的n-6/n-3PUFAs(30∶1)分別處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞24h，與對(duì)照組相比，各濃度組脂聯(lián)素的表達(dá)均下降，隨著濃度的增加，下降趨勢(shì)越明顯，當(dāng)濃度為50、100、200和400μmol/L時(shí)，表達(dá)顯著下降，比對(duì)照組分別減少44.83％(p=0.012)、49.14％(p=0.006)、48.28％(p=0.008)和63.97％(p=0.001)。
　　 與對(duì)照組相比，各濃度組PPARγ mRNA的表達(dá)均顯

16、著下降，隨著濃度的增加，下降趨勢(shì)越明顯，比對(duì)照組分別減少27.59％(p=0.001)、22％(p=0.001)、37％(p=0.000)、50％(p=0.000)和56％(p=0.000)。
　　 經(jīng)Pearson相關(guān)分析，脂聯(lián)素mRNA表達(dá)與PPARγ mRNA表達(dá)總體趨勢(shì)存在顯著正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)系數(shù)r=0.793，P=0.000。
　　 2.n-6/n-3PUFAs構(gòu)成對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素蛋白表達(dá)的影響

17、r>　　 2.1 n-6/n-3PUFAs為1∶1時(shí)對(duì)脂聯(lián)素蛋白表達(dá)的影響以不同濃度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(1∶1)分別處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞24h，與對(duì)照組相比，各濃度組脂聯(lián)素的表達(dá)均增加，50、200、400μmol/L處理組脂聯(lián)素蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比略有升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);25、100μmol/L處理組對(duì)照組相比，脂聯(lián)素蛋白表達(dá)分別顯著增加24.77％

18、(P＜0.05)、28.50％(P＜0.05)。
　　 2.2 n-6/n-3PUFAs為5∶1時(shí)對(duì)脂聯(lián)素蛋白表達(dá)的影響以不同濃度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(5∶1)分別處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞24h，與對(duì)照組相比，除400μmol/L濃度組脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)略有降低(5.88％)外，其他各濃度組脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)均增加，50、100、200μmol/L處理組脂聯(lián)素蛋白表達(dá)與對(duì)照

19、組相比略有升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);25μmol/L處理組對(duì)照組相比，脂聯(lián)素蛋白表達(dá)顯著增加15.11％(P＜0.05)。
　　 2.3 n-6/n-3PUFAs為10∶1時(shí)對(duì)脂聯(lián)素蛋白表達(dá)的影響以不同濃度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(10∶1)分別處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞24h，與對(duì)照組相比，在濃度為25、50、100μmol/L時(shí)，脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組，

20、在100μmol/L時(shí)最為顯著，比對(duì)照組增加14.32％(P＜0.05);隨著濃度的增加，脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)下降，在400μmol/L時(shí)顯著低于對(duì)照組，減少16.21％(P＜0.05)。
　　 2.4 n-6/n-3PUFAs為20∶1時(shí)對(duì)脂聯(lián)素蛋白表達(dá)的影響以不同濃度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(20∶1)分別處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞24h，與對(duì)照組相比，在濃度為25、50、1

21、00、200μmol/L時(shí)，脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)無(wú)顯著差異，隨著濃度的增加，脂聯(lián)素蛋白表達(dá)下降，在400μmol/L時(shí)顯著低于對(duì)照組，減少26.57％(P＜0.05)。
　　 2.5 n-6/n-3PUFAs為30∶1時(shí)對(duì)脂聯(lián)素蛋白表達(dá)的影響以不同濃度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(30∶1)分別處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞24h，與對(duì)照組相比，各濃度組脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)均降低，在50、1

22、00、200、400μmol/L時(shí)顯著低于對(duì)照組，分別減少51.54％(P=0.000)、52.04％(P=0.000)、62.34％(P=0.000)、61.93％(P=0.000)。
　　 結(jié)論：
　　 1.n-6/n-3PUFAs構(gòu)成比的不同對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的影響不同，在n-6/n-3PUFAs構(gòu)成比為1∶1和5∶1時(shí)顯著上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)，隨著n-6/n-3PUFAs構(gòu)成比的增加，對(duì)脂聯(lián)素表達(dá)的促進(jìn)

23、作用逐漸下降，在30比1時(shí)完全抑制脂聯(lián)素的表達(dá)。
　　 2.在一定濃度范圍(25、50、100μmol/L)內(nèi)，n-6/n-3PUFAs能上調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的表達(dá)，呈劑量依賴(lài)關(guān)系;在200μmol/L濃度以上時(shí)多呈現(xiàn)為抑制脂聯(lián)素表達(dá)。n-3PUFAs比n-6PUFAs更能促進(jìn)脂聯(lián)素的表達(dá)。
　　 3.經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素與PPARγ基因表達(dá)之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，提示n-6/n-3PUFAs影響脂聯(lián)素的表

24、達(dá)有可能通過(guò)激活或抑制PPARγ的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　 4.本研究結(jié)果提示脂肪酸的構(gòu)成、濃度等都是影響脂聯(lián)素表達(dá)的重要因素，n-6PUFAs在適當(dāng)范圍（n-6/n-3PUFAs為1∶1和5∶1）內(nèi)可能上調(diào)脂聯(lián)素PPARγ基因的表達(dá)，但是隨著n-6/n-3PUFAs比例的增加主要表現(xiàn)為抑制作用，而n-3PUFAs則主要表現(xiàn)為上調(diào)脂聯(lián)素和PPARγ基因的表達(dá)，由此可以推測(cè)可以通過(guò)調(diào)整膳食脂肪酸n-6/n-3PUFAs構(gòu)成比、濃度等來(lái)增