牙鲆(Paralichthys olivaceus)冷誘導RNA結合蛋白(CIRP)基因克隆、表達分析及3D結構預測.pdf

1、冷誘導RNA結合蛋白(Cold-inducible RNA-binding protein,CIRP)是富含甘氨酸(Gly)的RNA結合蛋白家族成員之一,是一類重要的mRNA分子伴侶蛋白。冷誘導RNA結合蛋白是第一個從哺乳動物中分離得到的冷休克蛋白。該蛋白在冷休克或冷誘導過程中對細胞具有重要的生理作用。自從冷誘導RNA結合蛋白基因在哺乳動物中被克隆得到以后,學者們在哺乳動物和兩棲類中對其進行了廣泛的研究。隨著研究的深入,研究結果表明該蛋

2、白在許多生理過程中起重要作用。例如,冷誘導RNA結合蛋白對兩棲類的冬眠、生物節(jié)律性周期的維持以及正常胚胎發(fā)育均具有重要作用。目前,關于冷誘導RNA結合蛋白對魚類正常條件下的生理及脅迫條件下的相關作用研究相對較少。對鯉魚生長相關EST-SSRs標記的分析及大菱鲆性別相關基因研究分別發(fā)現(xiàn)冷誘導RNA結合蛋白與生長和性別相關。因此,本研究中對牙鲆冷誘導RNA結合蛋白基因進行克隆和表達分析,并初步探索其表達調(diào)控機制及其發(fā)揮功能的機制。
　

3、　本研究中,首先通過同源克隆和RACE技術克隆得到牙鲆CIRP基因cDNA全長序列。該基因cDNA全長1596bp,其中ORF長597bp,編碼的蛋白由198個氨基酸殘基組成。預測發(fā)現(xiàn)該蛋白序列N端包含RRM結構域,C端富含甘氨酸(Gly)并且存在Arg-Gly-Gly(RGG)重復序列。
　　通過PCR擴增得到了牙鲆CIRP基因全長序列。通過分析可知,該基因包含7個外顯子和6個內(nèi)含子,并且所有的內(nèi)含子均符合GT-AG規(guī)則。利用染

4、色體步移法克隆得到了4K長的該基因的5'側翼序列,并在啟動子區(qū)域鑒定出了許多轉(zhuǎn)錄因子結合位點。除了HSF、SRY等轉(zhuǎn)錄因子結合位點外,在外顯子1區(qū)域附近預測到一個CpGs位點。通過對不同性別個體、不同組織該區(qū)域DNA甲基化水平研究發(fā)現(xiàn)該區(qū)域甲基化水平較低。
　　通過熒光實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)CIRP基因在牙鲆成體各個組織中廣泛表達,并且在卵巢中表達量最高,在其他組織中表達水平較低。對牙鲆不同發(fā)育時期胚胎的定量PCR分析發(fā)現(xiàn),在牙鲆

5、卵細胞中CIRP基因具有表達且表達的mRNA是母源性的。同時研究發(fā)現(xiàn)該基因的表達在囊胚期和神經(jīng)胚期間上調(diào)并且達到峰值后逐漸下降。
　　為了獲得冷誘導RNA結合蛋白與mRNA相互作用的信息,對牙鲆CIRP蛋白的3D模型結構進行了預測。預測結果顯示在該蛋白分子表面具有一個裂縫結構。這暗示了其與mRNA分子的作用機制。為了進一步研究該蛋白與mRNA的研究機制而構建了表達載體,為進一步得到該蛋白奠定基礎。
　　總之,本研究的結果顯示