水楊酸在葡萄高溫脅迫過(guò)程中的信號(hào)作用及與蛋白質(zhì)磷酸化關(guān)系的研究.pdf

1、該研究以葡萄'京秀'(Vitis vinifera L.cv.Jingxiu)一年生扦插苗萌芽后70天的苗和該品種坐果后30天的果實(shí)為試材,分別用40℃高溫和150μmol/L SA不同時(shí)間處理后,探討了高溫脅迫和水楊酸(SA)對(duì)葡萄葉片和果肉細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的誘導(dǎo)和活性的影響,從分子水平上進(jìn)一步研究了SA作為信號(hào)分子在高溫脅迫中的作用.主要結(jié)果如下:高溫脅迫和SA處理均激活了葉片中能將底物MBP磷酸化的蛋白激酶,當(dāng)MBP濃度為0.5mg

2、/mL時(shí)該激酶活性達(dá)到最高值,其后,隨底物濃度的增大,活性出現(xiàn)下降趨勢(shì).該蛋白激酶對(duì)底物組蛋白-Ⅲ(histone-Ⅲ)沒(méi)有作用.反應(yīng)體系中ATP濃度以50μmol/L為宜,濃度過(guò)高時(shí)激酶活性下降.Mg<'2+>濃度為5mmol/L時(shí)激酶活性達(dá)到最大值.Ca<'2+>對(duì)激酶活性的影響較小.Mn<'2+>對(duì)激酶活性的激活沒(méi)有作用.凝膠中底物磷酸化放射自顯影結(jié)果表明,被高溫脅迫10~60min和SA處理30~180min所激活的蛋白激酶的分

3、子量約為52kD,該蛋白激酶能將凝膠中所嵌入的髓鞘堿性蛋白(MBP)磷酸化,在放射自顯影中表現(xiàn)出很高的放射活性,而對(duì)凝膠中的histone-Ⅲ則無(wú)作用.在溶液反應(yīng)體系中該蛋白激酶對(duì)MBP也表現(xiàn)出很高的磷酸化活性,而對(duì)histone-Ⅲ卻無(wú)作用.Ca<'2+>對(duì)其活性變化無(wú)顯著影響.在以MBP為底物的反應(yīng)體系中,pH為7.5時(shí),激酶的活性最高.酪氨酸特異性蛋白磷酸酶(YOP)對(duì)該激酶的活性有顯著的鈍化作用.結(jié)果表明該52kD蛋白激酶是MA

4、PK家族中的一種.采用果實(shí)圓片溫育法,對(duì)果肉細(xì)胞進(jìn)行高溫和SA處理的結(jié)果表明:高溫脅迫5~20min和SA處理5~60min均分別激活了果肉細(xì)胞中的蛋白激酶,放射自顯影顯示出在52kD處凝膠中的MBP被磷酸化,以histone-Ⅲ為底物時(shí),則在42kD處histone-Ⅲ被磷酸化.在液體反應(yīng)體系中,以MBP為底物有Mg<'2+>存在時(shí),52kD蛋白激酶有很強(qiáng)的磷酸化活性,此時(shí)Ca<'2+>對(duì)其活性沒(méi)有激活作用.與葉片一樣,YOP對(duì)52k

5、D蛋白激酶有鈍化作用.以histoneⅢ為底物有Ca<'2+>存在時(shí),42kD蛋白激酶有很強(qiáng)的磷酸化活性,對(duì)Ca<'2+>有明顯的依賴性.該激酶對(duì)CaM沒(méi)有依賴性,Calmidazolium和W7對(duì)該激酶的活性有強(qiáng)烈的抑制作用.高溫脅迫誘導(dǎo)了葡萄葉片和果肉細(xì)胞中SA含量的迅速上升.對(duì)葉片而言,脅迫30min時(shí),游離態(tài)和結(jié)合態(tài)SA含量均達(dá)到高峰,而果肉細(xì)胞中SA含量則在20min時(shí)達(dá)到高峰,隨后其含量迅速下降.無(wú)論在葉片中還是果肉細(xì)胞中均