CGI99在鹿茸軟骨組織生成中的作用.pdf

1、軟骨是細(xì)胞組成很單一的一種組織，具有很強(qiáng)的抗壓、抗撞擊能力。由于沒(méi)有血管分布，軟骨組織幾乎喪失了自我修復(fù)能力。而鹿茸軟骨是一種非常獨(dú)特的軟骨組織，它不僅在自然條件下能夠自我修復(fù)、再生，而且每年以一種驚人的速度再生。鹿茸季節(jié)性再生的特性使其成為研究器官及肢體再生基本過(guò)程的一個(gè)極具潛力的天然醫(yī)學(xué)模型。前期研究發(fā)現(xiàn) CGI99基因在鹿茸軟骨柱中高度表達(dá)（未發(fā)表），而在鹿茸的其他部位如血管中則幾乎不表達(dá)。因此推測(cè)其在鹿茸軟骨生成中具有一定的調(diào)節(jié)

2、作用，可能是軟骨發(fā)生過(guò)程中重要的調(diào)控分子，但目前CGI99基因在鹿茸軟骨生成過(guò)程中的具體作用機(jī)理還不清楚。研究表明，鹿茸的發(fā)生起始于生茸區(qū)骨膜(Antlerogenic Periosteum，AP)，是依賴干細(xì)胞的過(guò)程，故本實(shí)驗(yàn)以鹿茸生茸區(qū)骨膜細(xì)胞中的CGI99基因?yàn)檠芯繉?duì)象，在離體條件下初步探討該基因在鹿茸軟骨發(fā)生中的作用。
　　首先，針對(duì) CGI99基因序列，設(shè)計(jì)并篩選高分 RNAi靶序列，同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)陰性對(duì)照序列，將對(duì)應(yīng)的

3、shRNA序列化學(xué)合成后退火并連接，構(gòu)建重組載體質(zhì)粒 pLVTHM；通過(guò) PCR對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選并通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步鑒定，使用三質(zhì)粒系統(tǒng)(pLVTHM、pSPAX2、pMD2.G)共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞得到慢病毒粒子；用慢病毒顆粒感染 AP細(xì)胞，培養(yǎng)出可穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系，通過(guò)RT-PCR及Western-Blot從基因及蛋白水平檢測(cè)沉默效率；通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CGI99基因沉默對(duì)AP細(xì)胞增殖影響；對(duì)穩(wěn)定的AP細(xì)胞系進(jìn)行微粒體培養(yǎng)，將成

4、活的微粒體制作石蠟切片，染色后觀察切片中細(xì)胞團(tuán)的生長(zhǎng)分化趨勢(shì)；提取微粒體總 RNA并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，通過(guò) RT-PCR檢測(cè)軟骨標(biāo)志性基因CollagenⅡmRNA的表達(dá)情況，以鑒定微粒體中的軟骨分化趨勢(shì)。
　　結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選成功獲得了1條梅花鹿CGI99基因的高分RNAi靶序列，PCR及測(cè)序鑒定結(jié)果表明，成功構(gòu)建可重組質(zhì)粒 pLVTHM；通過(guò)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，成功獲得了重組慢病毒粒子；被重組慢病毒感染的AP細(xì)胞表達(dá)綠

5、色熒光蛋白，RT-PCR結(jié)果顯示，干擾效率達(dá)到70.8％，成功干擾了CGI99 mRNA在AP細(xì)胞中的表達(dá)；Western-Blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組AP細(xì)胞中CGI99蛋白明顯減少；MTT實(shí)驗(yàn)中三種細(xì)胞得出的數(shù)據(jù)，繪制曲線后基本趨于一致，說(shuō)明CGI99基因的沉默不會(huì)影響AP細(xì)胞的增殖；通過(guò)微粒體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)成功獲得了肉眼可見(jiàn)的致密球形微粒體；微粒體切片后染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組微粒體軟骨發(fā)生趨勢(shì)微弱，與陰性對(duì)照組及未感染的空白對(duì)照組對(duì)比差異顯著