小麥黃花葉病毒侵染性cDNA克隆及細胞侵染體系的建立.pdf

1、在中國,由小麥黃花葉病毒(Wheatyellow mosaic virus,WYMV)引起的小麥黃花葉病已嚴重的危害了小麥的生產.可是,由于寄主植物小麥遺傳背景復雜,寄主范圍狹窄,機械接種困難,體外病毒粒子不穩(wěn)定,病毒RNA容易降解等因素,給小麥黃花葉病毒的研究帶來了極大的困難.為了對小麥黃色花葉病毒進行深入地分子生物學研究,從細胞及分子水平上認識植物病毒的侵染和復制機制,該研究試圖建立一個適于WYMV侵染的室內活體細胞侵染系統(tǒng),包括病

2、毒侵染性cDNA克隆的構建、煙草原生質體和小麥細胞體系的培養(yǎng),以及體外轉錄物的接種和相關的檢測技術.該體系的建立為研究其它植物病毒奠定技術基礎.該研究首先利用5′RACE方法確認了WYMV-HC基因組的5′端的未知序列,其中RNA1的5′末端多出了15nt(5′-AAAATAAAACCACCA-3′),RNA2的5′末端則多出了12nt(5′-AAAATAAAACCA-3′).利用根據(jù)末端序列設計的引物,構建了T7啟動子驅動下的病毒基因

3、組的全長cDNA克隆.體外轉錄結果表明所獲得的cDNA克隆可以產生相應的WYMV RNAs.用電擊穿孔法將體外轉錄的WYMV RNAs接種于小麥品種鄂恩1號(Triticum aestivumLEEn.No.1)的愈傷組織和煙草懸浮細胞系BY-2的原生質體內,摸索建立了適用于WYMV病毒顆粒及體外轉錄RNA侵染植物細胞的侵染體系.對被接種細胞進行的Western blot和Northern blot檢測結果表明,體外合成的WYMVRNA

4、s可以在煙草細胞系BY-2和小麥細胞內復制、表達,即該研究所構建的WYMV cDNA克隆具有侵染活性.進一步實驗還證明RNA1的5′末端序列(無論是日本分離物5′末端序列還是潢川分離物的末端序列,或者是額外加的一個G對都不影響侵染性)及3′末端poly(A)尾長短(帶有26個A和4個A)對WYMV體外轉錄物的侵染活性也沒有明顯的影響.在此基礎上,進一步完善了該侵染體系.另外,該研究還利用這一侵染體系對WYMV RNA2編碼的P1蛋白的功

5、能進行了初步研究.通過構建在pSKCaasSK上的GFP與P1融合基因(包括N端和C端)的瞬時表達載體,用電穿孔法轉入細胞(煙草原生質體或小麥細胞),用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在煙草原生質體內集中在細胞核內發(fā)光,而在小麥愈傷細胞內,熒光集中在細胞質內、細胞膜與細胞壁上.分析可能是因為小麥是病毒的天然寄主,所以在小麥細胞內,由于某些因子的存在,P1表現(xiàn)其在天然寄主內的功能,而在非天然寄主煙草細胞內,可能是因為缺乏某些與P1蛋白互作的因子,P1表